粘細(xì)菌纖維堆囊菌降解纖維素多酶復(fù)合體的確證和性質(zhì)分析.pdf

1、粘細(xì)菌是一類(lèi)特殊的革蘭氏陰性桿菌，能夠進(jìn)行滑行運(yùn)動(dòng)，具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為和形態(tài)發(fā)生過(guò)程，是一類(lèi)“生活在真核生物邊緣”的高等的原核生物類(lèi)群；產(chǎn)生眾多結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨(dú)特的生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物是粘細(xì)菌的另一重要特征。根據(jù)“食性”的差異可將粘細(xì)菌簡(jiǎn)單的劃分為溶細(xì)菌和溶纖維素兩個(gè)生理類(lèi)群。溶纖維素群中只有堆囊菌屬一個(gè)屬，纖維堆囊菌是其中的模式種。作為重要的微生物藥物(例如著名的埃博霉素)產(chǎn)生菌，纖維堆囊菌逐漸引起全球的廣泛關(guān)注。但是，對(duì)其最為

2、基本的微生物學(xué)特性——粘細(xì)菌中唯一能夠降解纖維素、半纖維素等生物大分子的類(lèi)群，相關(guān)研究則涉及很少。本文利用實(shí)驗(yàn)室所建立的國(guó)內(nèi)最大的粘細(xì)菌資源庫(kù)的優(yōu)勢(shì)，對(duì)纖維堆囊菌降解纖維素的基本性質(zhì)及相關(guān)酶類(lèi)進(jìn)行了研究。 纖維素是地球上最豐富的可再生有機(jī)資源，對(duì)纖維素的降解基本上是由微生物完成的。不同微生物降解纖維素時(shí)所采取的策略也不盡相同，主要表現(xiàn)在各種降解酶類(lèi)的作用機(jī)制和組織形式上。纖維堆囊菌能夠在以纖維素為唯一碳源的簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(如C

3、NST培養(yǎng)基)上生長(zhǎng)，可產(chǎn)生多種纖維素和半纖維素酶類(lèi)。所以，我們從表征其纖維素酶類(lèi)的基本性質(zhì)出發(fā)，開(kāi)展了相關(guān)研究。廣泛選取了13株纖維堆囊菌作為研究對(duì)象，對(duì)其在不同纖維素底物上的生長(zhǎng)形態(tài)、降解纖維素特征、分化發(fā)育能力以及多種纖維素和半纖維素酶類(lèi)的產(chǎn)生時(shí)間進(jìn)行了測(cè)定和比較。通過(guò)對(duì)各菌株在濾紙纖維素底物上生長(zhǎng)和子實(shí)體形成情況的分析，我們將其總結(jié)為兩種不同的類(lèi)型：一種類(lèi)型是以接種點(diǎn)為中心，先向四周快速擴(kuò)展，在擴(kuò)展過(guò)程中伴隨著濾紙纖維素的降解，

4、達(dá)到一定程度以后，整個(gè)菌落的細(xì)胞同時(shí)開(kāi)始聚集，并形成子實(shí)體結(jié)構(gòu)，其子實(shí)體基本在生長(zhǎng)同一時(shí)期形成，并布滿(mǎn)整個(gè)菌落，這種類(lèi)型的特點(diǎn)就是幾乎所有的菌體細(xì)胞都處于相同的生長(zhǎng)時(shí)期，細(xì)胞生長(zhǎng)和分化發(fā)育具有一定的同步性；另一種類(lèi)型是在菌落外圍菌體細(xì)胞仍在增殖擴(kuò)展時(shí)，靠近中心部位的菌體則已開(kāi)始聚集和進(jìn)入分化發(fā)育階段，首先形成子實(shí)體結(jié)構(gòu)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，外圍細(xì)胞也逐漸形成子實(shí)體結(jié)構(gòu)，其子實(shí)體最終布滿(mǎn)菌落中心部位或整個(gè)菌落，這種類(lèi)型的特點(diǎn)就是菌落中不同

5、部位的細(xì)胞所處的生長(zhǎng)時(shí)期并不完全一致，從中心到外圍具有不規(guī)則的階梯性。纖維堆囊菌對(duì)于其它纖維素類(lèi)底物也表現(xiàn)出了良好的降解能力。13株菌株都可以在羧甲基纖維素(CMC)和木聚糖平板上生長(zhǎng)，經(jīng)剛果紅染色形成透明的降解圈：部分菌株還可在木聚糖和微晶纖維素平板上形成大型菌膜。酶活性分析表明，纖維堆囊菌的纖維素酶類(lèi)是與細(xì)胞和纖維素底物相結(jié)合的，但酶活性偏低，與其快速降解纖維素的能力不相符。同時(shí)發(fā)現(xiàn)各種酶的活性不僅總體變化趨勢(shì)比較相似，而且在時(shí)間上

6、也有較強(qiáng)的同步性。在對(duì)纖維堆囊菌降解纖維素大分子的性質(zhì)有了基本認(rèn)知后，我們選擇Sorangium cellulosum S09733-1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模式材料。 首先，我們對(duì)S09733-1在濾紙纖維上的細(xì)胞行為進(jìn)行了表征。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在菌體的生長(zhǎng)階段，只有與菌體接觸到的纖維才能夠被降解，而且處于此階段的菌體表面產(chǎn)生了一種疣狀突起結(jié)構(gòu)；在生長(zhǎng)后期細(xì)胞發(fā)生聚集并開(kāi)始分化發(fā)育過(guò)程時(shí)，伴隨纖維素降解的停止此結(jié)構(gòu)消失。我

7、們推測(cè)此種突起結(jié)構(gòu)可能與纖維素降解相關(guān)。 然后，對(duì)S09733-1的纖維素酶系進(jìn)行了分離純化。利用兩步抽提法和凝膠層析技術(shù)，我們得到了一個(gè)分子量在1000-2000KDa之間、具有內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶等多種酶活力的高分子量組份。經(jīng)SDS-PAGE和HPLC分析，進(jìn)一步確定此高分子量組份分子量范圍在1500-2000KDa之間，由10個(gè)以上的蛋白組成，具有多種不同的纖維素降解酶活，初步證實(shí)了纖維堆囊菌中

8、可能存在一類(lèi)降解纖維素的多酶復(fù)合體。為了進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論，我們采取了兩條基本思路：一是從單一酶組分出發(fā)，克隆并異源表達(dá)復(fù)合體中的一個(gè)酶組分，以此作為探針，對(duì)復(fù)合體進(jìn)行細(xì)胞定位，并揭示其與細(xì)胞表面突起結(jié)構(gòu)的關(guān)系；另一思路是對(duì)于復(fù)合體中所有蛋白組分進(jìn)行分析和鑒定，在闡明其基本功能的基礎(chǔ)上，揭示復(fù)合體的結(jié)構(gòu)組織模式。 本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中，利用各種纖維素、半纖維素降解酶類(lèi)基因設(shè)計(jì)引物對(duì)S09733-1基因組進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，但是由于

9、纖維堆囊菌與其它纖維素降解微生物的低同源性，我們只獲得了幾個(gè)木聚糖酶基因。考慮到復(fù)合體中表現(xiàn)出了較高的木聚糖酶活性，我們選取了其中一個(gè)木聚糖酶的催化域(糖苷水解酶第10家族)編碼片段xynF，將之插入表達(dá)載體pET-22b(+)，在受體菌株Ecoli BL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)。重組蛋白XynF在胞內(nèi)形成包涵體。經(jīng)包涵體提取并利用其帶有的組氨酸標(biāo)簽用Ni2<'2+>柱的方法進(jìn)行了分離純化。以純化的重組蛋白XynF為抗原進(jìn)行抗體制備

10、，獲得了效價(jià)為1：16的多克隆抗體。以此多克隆抗體為一抗，進(jìn)行了S09733-l降解纖維素多酶復(fù)合體的免疫印跡分析。結(jié)果顯示，該多克隆抗體不僅可以與XynF發(fā)生強(qiáng)烈結(jié)合，還可以與本實(shí)驗(yàn)室得到的S09733-1中另兩個(gè)完整木聚糖酶基因異源表達(dá)蛋白XynA和XynB發(fā)生交叉反應(yīng)，因?yàn)槠浯呋Y(jié)構(gòu)域同屬于糖苷水解酶第10家族(F／10)。對(duì)S09733-1木聚糖酶基因xynA和xynB所編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)蛋白都只有

11、兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為F／10家族催化域，另一個(gè)為一疏水結(jié)構(gòu)域，功能未知。此種結(jié)構(gòu)與纖維小體中的組成酶類(lèi)有一定的相似之處。在對(duì)SDS．PAGE后的復(fù)合體進(jìn)行免疫印跡分析時(shí)，出現(xiàn)三條雜交條帶，說(shuō)明在此酶復(fù)合體中至少存在三種具有F／IO家族催化域的木聚糖酶。 通過(guò)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，對(duì)復(fù)合體的細(xì)胞分布進(jìn)行了定位，結(jié)果表明： (1)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S09733-1菌體細(xì)胞表面可發(fā)出綠色熒光，表明其復(fù)合體存在于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞表面并與細(xì)胞結(jié)

12、合； (2)菌體細(xì)胞表面的熒光并不是均勻分布的，這與利用掃描電鏡在菌體細(xì)胞表面觀察到的突起結(jié)構(gòu)相吻合； (3)當(dāng)S09733-1菌體聚集和形成子實(shí)體后，聚集后的細(xì)胞和成熟子實(shí)體內(nèi)的粘孢子都未檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明該時(shí)期的細(xì)胞表面已不存在相關(guān)的降解酶類(lèi)。 (4)由于培養(yǎng)使用的M26培養(yǎng)基中不含有纖維素成分，表明S09733-1的纖維素降解酶類(lèi)可能是組成型表達(dá)。 利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思路，運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)

13、對(duì)S09733-1降解纖維素多酶復(fù)合體的組成進(jìn)行了分析。雙向電泳(17cmxl7cm的聚丙烯酰胺凝膠)分離結(jié)果顯示，復(fù)合體呈現(xiàn)出30-40個(gè)清晰的蛋白點(diǎn)，分子量從10KDa到IOOKDa以上，等電點(diǎn)主要集中在偏酸性范圍，偏堿性區(qū)域蛋白點(diǎn)很少。這一結(jié)果證實(shí)了復(fù)合體是由多個(gè)不同類(lèi)型的蛋白組分構(gòu)成，呈現(xiàn)出組分的多樣性。將其中30個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行摳點(diǎn)和膠內(nèi)酶解，用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)分析，得到了21個(gè)有意義

14、的質(zhì)譜圖譜，其中1個(gè)蛋白組分被初步鑒定為內(nèi)切葡聚糖酶。由于堆囊菌的特殊性，其他20個(gè)蛋白樣品沒(méi)有檢索到完全可信的結(jié)果，但在其各自的匹配蛋白列表中，有多種纖維素降解相關(guān)的酶類(lèi)處于相對(duì)較高的得分。所以，我們正在進(jìn)行的工作是希望通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)得到蛋白點(diǎn)的肽段序列信息，通過(guò)序列檢索或者結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。 本文的結(jié)果不但首次對(duì)于纖維堆囊菌降解纖維素類(lèi)物質(zhì)的基本特性進(jìn)行了較為全面的表征，而且證明了其纖維素降解酶