IBDV雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立和膠體金試紙條的研制.pdf

1、傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵害雛雞淋巴組織，特別是中樞免疫器官—法氏囊為主要特征的傳染病。該病不僅引起患病動物死亡，而且還導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，是引起我國及世界養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重的主要傳染病之一。近幾年，由于變異株和超強(qiáng)毒株(vvIBDV)的出現(xiàn)，使本病的發(fā)生和流行出現(xiàn)新的特點，對養(yǎng)雞業(yè)的危害更加嚴(yán)重，并給臨床診斷和治療帶來了一定困難。因此，研制快速、準(zhǔn)確的診斷方法對IBD的防治至關(guān)重要。本研究旨在制備抗IBD

2、V的單克隆抗體，建立IBDV雙抗體夾心ELISA和膠體金免疫層析試紙條檢測方法，為IBD的快速檢測和診斷提供幫助。
　　 1.分泌抗傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立
　　 用純化的IBDV抗原免疫BALB/c小鼠，制備脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系融合，獲得3株能穩(wěn)定分泌抗IBDV VP2蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1D11、2G8和2E5，抗體亞類分別為IgG1、IgG2bκ和IgG1κ，誘

3、生腹水的抗體效價分別為107、106和107。間接免疫熒光試驗(IFA)表明，3株單克隆抗體均與感染IBDV的DF-1細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng);免疫印跡(western b1ot)分析，單抗1D11和2E5與純化IBDV分別在40KDa和32KDa處產(chǎn)生特異性蛋白條帶，而單抗2G8未產(chǎn)生特異性蛋白條帶;在病毒中和試驗中，2G8的腹水中和效價為104，而1D11和2E5無中和活性。相加ELISA結(jié)果顯示，1D11和2G8識別的抗原表位相似或相近

4、，2G8和2E5識別的抗原表位差異較大。
　　 2.傳染性法氏囊病病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立
　　 單抗腹水經(jīng)HiTrapTM Protein G親和層析柱純化后，以1D11為捕獲抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體2E5為檢測抗體，建立了IBDV雙抗體夾心ELISA檢測方法。試驗結(jié)果表明:所建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法與傳染性支氣管炎病毒(IBV)、減蛋綜合癥病毒(EDS-76V)、禽流感病H9N2亞

5、型(AIV-H9N2)、新城疫病毒(NDV)均無交叉反應(yīng)，特異性良好;該方法對IBDV的最低檢出量為102 TCID50;用夾心ELISA、AGP和RT-PCR三種方法同步檢測97份臨床樣品，檢測結(jié)果表明，雙抗體夾心ELISA與RT-PCR的符合率達(dá)95.3％，而AGP試驗與RT-PCR的符合率為82.5％。本研究建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法具有良好的特異性、敏感性和臨床實用性，為開發(fā)商品化IBDV抗原檢測試劑盒提供前期基礎(chǔ)，具有

6、很好的臨床應(yīng)用前景。
　　 3.傳染性法氏囊病病毒膠體金免疫層析試紙條的研制
　　 本研究采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記純化的抗IBDV單克隆抗體2E5作為捕捉抗體，將純化的抗IBDV單克隆抗體2G8和羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜(NC)上，分別作為檢測線和質(zhì)控線，優(yōu)化反應(yīng)條件，組裝成膠體金免疫層析試紙條。結(jié)果表明:該試紙條與IBV、EDS-76V、AIV-H9N2、NDV均無交叉反應(yīng);其對IBDV的最低檢出