犬溫?zé)岵《締慰寺】贵w夾心ELISA檢測(cè)方法和膠體金免疫層析試紙條的研究.pdf

1、犬瘟熱(Canine distemper, CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的食肉目中許多動(dòng)物的一種急性、高度接觸性的傳染病，發(fā)病死亡率高達(dá)90％以上（殷震等，1997）。雖然近20年在易感動(dòng)物中已經(jīng)廣泛性的接種CDV疫苗，但隨著生態(tài)環(huán)境的改變、動(dòng)物的進(jìn)化以及CDV毒株的不斷變異，仍有大量關(guān)于CDV弱毒疫苗引起常規(guī)免疫犬爆發(fā)CD病情或疫情的報(bào)道(Simon-Martínez J，2008)

2、，因此CD目前仍對(duì)犬、毛皮類經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖以及野生動(dòng)物保護(hù)造成嚴(yán)重危害的重大疫病之一(Takayama et al，2009;Krakowka et al，1982)。
　　 CDV屬于副粘病毒科麻疹病毒屬，為有囊膜不分節(jié)片的負(fù)義線性RNA病毒，被認(rèn)為只有一個(gè)血清型（陸承平，2011）。病毒顆粒主要由核衣殼蛋白(N)、血凝蛋白(H)、融合蛋白(F)、大蛋白(L)、基質(zhì)膜蛋白(M)和磷蛋白(P)組成（殷震等，1997）。其中N蛋白是

3、含量最多且保守性最強(qiáng)的免疫原性蛋白。H蛋白和F蛋白在CD的免疫和預(yù)防方面起著重要作用。CDV具有廣泛的組織細(xì)胞嗜性，可感染多種細(xì)胞和組織，其中親嗜最強(qiáng)的是上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，一旦發(fā)病嚴(yán)重破壞機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，導(dǎo)致免疫抑制，并引起其它細(xì)菌或病毒病的混合感染。因此，犬瘟熱的及早發(fā)現(xiàn)和快速準(zhǔn)確地診斷，是犬瘟熱治療和防控的關(guān)鍵，獲得簡(jiǎn)便、快速、敏感、實(shí)用的CDV快速檢測(cè)方法仍是亟需解決的問(wèn)題。
　　 迄今，已報(bào)道檢測(cè)CDV的方法

4、有病毒分離、包涵體檢查法、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、免疫熒光抗體技術(shù)、免疫組化技術(shù)、RT-PCR方法等(Sun Z et al，2010; Hoylandet al，2003)，但這些方法存在著繁瑣或重復(fù)性差等缺點(diǎn)，對(duì)試驗(yàn)人員和試驗(yàn)條件要求較高，難以在基層推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)旨在建立單克隆抗體(MAb)夾心ELISA檢測(cè)方法和膠體金免疫層析試紙條，為CDV的快速檢測(cè)提供技術(shù)支撐。
　　 1.犬瘟熱MAb的制備
　　 本研究利用

5、前期從非典型CD病犬組織（肝臟、脾臟）中分離的CDVNJ01株作為免疫原，采用蔗糖密度梯度離心法提純CDV。用純化后CDV免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，制備免疫脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞株，并通過(guò)間接ELISA方法進(jìn)行篩選，獲得4株能穩(wěn)定分泌抗CDV抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為A2、H4、F7和G12。4株雜交瘤細(xì)胞株特異性檢測(cè):間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)結(jié)果顯示，4株MAb能與感染CDV的Vero細(xì)胞反應(yīng)，

6、出現(xiàn)綠色熒光，而與未接毒的Vero細(xì)胞無(wú)熒光，具有較好特異性;間接ELISA交叉試驗(yàn)，結(jié)果證明4株雜交瘤細(xì)胞株只與CDV反應(yīng)，與犬副流感病毒(CPIV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬冠狀病毒(ccv)和犬腺病毒1型(CAV-1)、Vero細(xì)胞培養(yǎng)物和犬陰性血清無(wú)反應(yīng)，特異性良好。間接ELISA方法測(cè)定4株MAb的細(xì)胞上清和腹水效價(jià)，結(jié)果其上清的抗體效價(jià)均為103，誘生腹水的抗體效價(jià)為105～106。通過(guò)非抗原依賴方法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞株亞類，測(cè)

7、定結(jié)果顯示這四株雜交瘤細(xì)胞株亞類均為IgG1，輕鏈均為κ型。通過(guò)中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定中和病毒的活性，結(jié)果表明這四株MAb均具有中和病毒的能力，且MAbA2和G12腹水的中和效價(jià)為104。
　　 2.單抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立
　　 通過(guò)相加ELISA試驗(yàn)對(duì)獲得的4株MAb的抗原表位進(jìn)行分析，試驗(yàn)證明這4株MAb針對(duì)不同抗原表位。選取相加指數(shù)最高的兩株MAb G12、A2來(lái)建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，通過(guò)配對(duì)試驗(yàn)，確定

8、捕獲抗體和酶標(biāo)抗體。通過(guò)Protein G親和層析柱對(duì)G12和A2腹水進(jìn)行純化，采用過(guò)碘酸鈉標(biāo)記法，用HRP標(biāo)記純化的MAb A2，以A2-HRP酶標(biāo)抗體復(fù)合物為檢測(cè)抗體，純化MAb G12為捕獲抗體，建立檢測(cè)方法。通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)條件確定A2-HRP，G12的最佳工作濃度，工作條件及工作時(shí)間。用優(yōu)化后的夾心ELISA方法同步檢測(cè)CDV、犬副流感病毒(CPIV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬冠狀病毒(ccv)和犬腺病毒1型(CAV-1)、Ver

9、o細(xì)胞培養(yǎng)物和犬陰性血清，檢驗(yàn)該方法的特異性，試驗(yàn)表明該夾心ELISA檢測(cè)方法具有良好特異性。將純化CDV稀釋成不同濃度，用建立的方法檢測(cè)，以讀取的OD450nm值為縱坐標(biāo)，抗原稀釋濃度做橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定該方法的靈敏度。采用同批次和不同批次包被的ELISA板條，分別檢測(cè)臨床20份犬眼鼻分泌物樣品（CDV陽(yáng)性和陰性各10份），計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)，測(cè)得其變異系數(shù)小于6％，顯示該方法具有良好的重復(fù)性。用該方法與RT-PCR方法同時(shí)

10、檢測(cè)57份臨床樣品，兩種方法的符合率為100％。本實(shí)驗(yàn)建立的單抗夾心ELISA方法具有特異、敏感、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量臨床樣品檢測(cè)。
　　 3.膠體金免疫層析試紙條的研制
　　 同上采用MAb A2和MAb G12建立膠體金免疫層析檢測(cè)方法。將純化的MAb A2做為標(biāo)記抗體，通過(guò)檸檬酸三鈉還原法制備金顆粒-A2復(fù)合物，并將此復(fù)合物固定于玻璃纖維素膜上。將純化的MAbG12做為捕獲抗體，固定于硝酸纖維素(NC)膜上