塑化劑DNOP對(duì)胰島β細(xì)胞DNA氧化性損傷機(jī)制探討.pdf

1、目的：鄰苯二甲酸二正辛酯（di-n-octy1 phthalate，DNOP）是一種常見(jiàn)的塑化劑，其具有良好的可塑性，因此廣泛應(yīng)用于塑料制品中。塑料包裝產(chǎn)品中DNOP的急性毒性比較低，人體在一定劑量的攝入后往往沒(méi)有急性表現(xiàn)，但其慢性毒性對(duì)人類的危害較大，研究發(fā)現(xiàn):DNOP可通過(guò)氧化應(yīng)激途徑引起胰島素抵抗，進(jìn)而引發(fā)Ⅱ型糖尿病。吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline-quinone，PQQ)是人體中一種必不可少的生理調(diào)節(jié)劑，文獻(xiàn)表明P

2、QQ對(duì)由細(xì)胞氧化應(yīng)激引發(fā)的疾病具有一定的治療效果。酒精是生活中常見(jiàn)的物質(zhì)，其應(yīng)用范圍十分廣泛，在白酒中有大量的酒精成分，其毒性與細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。近期，我國(guó)著名品牌白酒中發(fā)現(xiàn)了塑化劑，更提高了人們對(duì)酒精與DNOP聯(lián)合作用的關(guān)注程度。本課題選取大鼠胰島β細(xì)胞Ins-1為研究對(duì)象，研究DNOP對(duì)胰島β細(xì)胞Ins-1的毒性機(jī)制，并研究PQQ對(duì)Ins-1細(xì)胞的保護(hù)作用及酒精與DNOP的聯(lián)合作用。
　　方法：本課題選取大鼠胰島β細(xì)胞Ins-

3、1為研究對(duì)象，首先使用MTT毒性試驗(yàn)測(cè)定不同濃度DNOP對(duì)Ins-1細(xì)胞的毒性作用，并確定其半數(shù)致死量。使用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（SCGE）檢測(cè)DNOP對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞Ins-1DNA的損傷作用及PQQ對(duì)Ins-1細(xì)胞DNA的保護(hù)作用，酒精的聯(lián)合作用。為得出DNOP對(duì)Ins-1細(xì)胞DNA損傷的相關(guān)機(jī)制及PQQ的保護(hù)作用，酒精的聯(lián)合作用，使用苯二醛（OPT）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）含量，使用吖啶橙（AO）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性，

4、使用2’，7’-二氫二氯熒光素（DCFH）來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），使用羅丹明123（Rhodamine123）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平。得出Ins-1細(xì)胞的還原型谷胱甘肽（GSH）水平，溶酶體穩(wěn)定性水平，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平及線粒體膜電位水平。在預(yù)處理試驗(yàn)中加入PQQ作為保護(hù)劑，觀察各項(xiàng)指標(biāo)。加入酒精與DNOP，觀察DNOP與酒精的作用結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：在

5、SCGE試驗(yàn)中，DNOP單獨(dú)處理胰島β細(xì)胞Ins-1后，使Ins-1細(xì)胞的DNA鏈出現(xiàn)斷裂損傷并呈劑量依賴關(guān)系。隨著DNOP劑量增加，拖尾現(xiàn)象逐漸增強(qiáng)，尾長(zhǎng)、尾距及尾DNA/頭DNA（%）與對(duì)照組相比差異具有顯著性；在PQQ預(yù)處理組中，胰島β細(xì)胞Ins-1的拖尾現(xiàn)象減弱，尾長(zhǎng)、尾DNA/頭DNA（%）、尾距均小于同劑量DNOP單獨(dú)處理組；在酒精預(yù)處理組中，胰島β細(xì)胞Ins-1的拖尾現(xiàn)象更強(qiáng)，細(xì)胞的尾長(zhǎng)、尾DNA/頭DNA（%）、尾距相對(duì)

6、于DNOP單獨(dú)處理組明顯增強(qiáng)。在細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）試驗(yàn)中，DNOP使Ins-1細(xì)胞的GSH水平降低；PQQ預(yù)處理組的GSH水平升高；相對(duì)于DNOP單獨(dú)處理組，酒精預(yù)處理組的GSH水平相對(duì)于同濃度DNOP單獨(dú)處理組降低。在細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性試驗(yàn)中，DNOP單獨(dú)處理組的溶酶體膜穩(wěn)定性降低，PQQ預(yù)處理組的溶酶體膜穩(wěn)定性升高，酒精預(yù)處理組中的溶酶體膜穩(wěn)定性相對(duì)于同濃度DNOP單獨(dú)處理組有所降低。在細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）試驗(yàn)中，D

7、NOP處理組的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，PQQ預(yù)處理組的細(xì)胞內(nèi)ROS水平有所降低，而酒精預(yù)處理組的細(xì)胞內(nèi)ROS水平相對(duì)于同濃度DNOP處理組有所升高。在細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位測(cè)定試驗(yàn)中，DNOP處理組細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平隨濃度增加而降低，PQQ預(yù)處理組的線粒體膜電位水平升高，而酒精預(yù)處理組的線粒體膜電位水平有所降低。
　　結(jié)論：在DNOP引起Ins-1細(xì)胞DNA損傷的氧化應(yīng)激途徑中，DNOP可使細(xì)胞的ROS水平升高，GSH水平降低，從而

8、對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，PQQ可減少細(xì)胞內(nèi)ROS的數(shù)量，提高細(xì)胞的GSH水平，減少細(xì)胞氧化應(yīng)激的損傷，酒精可加重DNOP對(duì)Ins-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。在DNOP引起Ins-1細(xì)胞DNA損傷的溶酶體—線粒體途徑中，DNOP可使Ins-1細(xì)胞的溶酶體膜穩(wěn)定性降低，并使細(xì)胞線粒體膜電位水平降低，PQQ可使Ins-1細(xì)胞的溶酶體膜穩(wěn)定性升高，線粒體膜電位水平上升，而酒精可使DNOP對(duì)溶酶體膜穩(wěn)定性及線粒體膜電位降低，從而加重DNOP對(duì)Ins-