人神經(jīng)肽Y Y5受體的克隆表達及其生物信息學分析.pdf

1、目前，肥胖已成為全球性的影響人類生活質量和壽命的最大威脅，是Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、高血壓、中風、骨關節(jié)炎以及一些特殊類型癌癥等疾病的主要誘因。據(jù)WHO統(tǒng)計全球有10億成人體重超標，其中至少有3億是肥胖患者；在我國，超重和肥胖人口也分別達到2億和6000萬。因此，肥胖已成為當前亟待解決的重大醫(yī)學和社會問題。隨著分子生物學和醫(yī)學研究水平的提高，科學家們普遍認為神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y,NPY)與肥胖的發(fā)生發(fā)展關系密切。NPY

2、是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強食欲增強因子，在腦尤其是室旁核中，無論是內源性還是外源性NPY都能刺激動物攝食?，F(xiàn)已證實，NPY對進食行為的這種調節(jié)功能是在NPY Y5受體(Neuropeptide Y Y5 Reeeptor,NPY5R)的介導下完成的，多種NPY5R激動劑均可誘導進食行為，NPY5R基因的反義寡核苷酸腦室注射可特異阻斷下丘腦NPY5R基因的翻譯，進而減少正常大鼠與肥胖大鼠的進食次數(shù)、延長它們的進食周期并減少其進食量，最終導致減肥

3、降脂。這暗示著NPY5R與肥胖的發(fā)生發(fā)展密切相關，并可作為一個治療肥胖的潛在的藥物靶標，而NPY5R抑制劑必將成為治療肥胖和飲食混亂的理想藥物。因此，通過分子生物學手段克隆表達純化獲得人NPY5R(hNPY5R)蛋白，并針對該蛋白構建高通量篩選模型，篩選NPY5R的抑制劑，將有助于治療肥胖藥物的開發(fā)。 本研究根據(jù)GenBank公布的hNPY5R基因編碼序列(GeneID：4889)設計引物，以人基因組為模板，PCR獲得hNPY5

4、R編碼序列，PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)過酶切連接克隆至表達載體pESP2中，構建好的重組質粒pESP2-hNPY5R通過CaCl2法轉入宿主菌E．coli JM109中；菌落PCR、酶切及測序鑒定重組質粒；將鑒定正確的重組質粒pESP2-hNPY5R電轉化粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01，然后對經(jīng)菌落PCR驗證后的陽性克隆誘導表達，超聲波破菌后12％SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)重組蛋白大小的條帶不明顯，初步推測該融合蛋白對宿主菌有較強毒性，從而

5、導致該蛋白的表達水平低下。 根據(jù)hNPY5R基因編碼序列設計另外一對引物，PCR得到hNPY5R編碼序列，構建重組質粒pET28a(+)-hNPY5R，轉化表達菌株BL21(DE3)，菌落PCR驗證后對重組菌進行終濃度為0.5mM的IPTG誘導，測其OD600值，繪制生長曲線；同時進行12％SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)重組融合蛋白大小的條帶不明顯，由此初步認為該融合蛋白對宿主菌的生長有抑制作用，可能有較強的細胞毒性，重組菌誘導

6、后的生長曲線的變化也證實了這一點。本論文應用VectorNT9.0、SignalP、ClustalX1.83等生物信息學軟件對人NPY、NPY5R進行一級結構、功能位點、信號肽、親/疏水性及跨膜結構等的分析；通過網(wǎng)上預測蛋白質二級結構的服務器PSIPRED(Position Specific Iterated PRED)Server(http//bioinf．cs．ucL.ac．uk/prispred/)對hNPY5R蛋白進行二級結構分