耐熱木聚糖酶的體外分子進(jìn)化及其生物信息學(xué)分析.pdf

1、木聚糖酶(E.C3.2.1.8)是一類以內(nèi)切方式降解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷鍵的酶系。它對(duì)自然界中大量存在的半纖維素起著重要的作用，該酶廣泛應(yīng)用于造紙、食品、飼料添加等方面。其中耐熱木聚糖酶由于其耐熱性好，被廣泛運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)特別是造紙工業(yè)，因此已受到廣泛的關(guān)注。 本研究以高產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉C3486(Aspergillus niger C3486)的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增出木聚糖酶的特異性條帶，連接到原核表達(dá)載

2、體pET32a(+)，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后得到目的蛋白，純化后所得蛋白Xyn-1不具有木聚糖酶活性。而后將木聚糖酶基因連接到真核表達(dá)載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母Pichia pastoris GS115中，純化所得的木聚糖酶Xyn-2具有一定的酶活性。 然后再以Aspergillus niger C3486總RNA為摸板，進(jìn)行RT-PCR后，重新轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，所得的木聚糖酶Xyn-3

3、也具有一定的酶活性。通過木聚糖酶DNA與cDNA的序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該酶的的基因組中且一個(gè)大小約為50 bp的內(nèi)含子。 通過生物信息學(xué)分析表明，該酶含有187個(gè)氨基酸，具有信號(hào)肽。并且具有典型的木聚糖酶保守區(qū)域，利用在線預(yù)測(cè)該酶進(jìn)行三級(jí)結(jié)的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該酶是一個(gè)以β-折疊為主為的蛋白酶，形成一個(gè)緊密的球狀蛋白。 通過Error PCR和DNA Shuffling體外分子進(jìn)化技術(shù)，將來自于黑曲霉與里氏木霉的木聚糖酶基因進(jìn)