堿基錯配對核酸穩(wěn)定性及其解鏈溫度（Tm）的影響.pdf

1、目的：基因芯片技術是二十世紀生命科學領域重大的發(fā)明之一。它的應用前景非常廣泛，然而，基因芯片的實際應用還有很多的限制，最主要的原因是目前它的檢測準確度還沒有達到準確無誤的程度，經(jīng)常出現(xiàn)假性信號，誤導檢測結果?；蛐酒瑱z測是基于核酸的互補雜交原理，由于檢測目的的不同，芯片表面探針的長短和堿基序列各不相同，其與互補鏈的解鏈溫度也高低不一。為了確保芯片表面的所有探針在同一檢測溫度下，都能準確無誤地識別出各自的靶標序列，探針的解鏈溫度應盡量設計

2、的一致，同時還應盡量增大探針與靶標序列和與非靶標核酸結合的解鏈溫度的差異。 有人嘗試將具有更高結合能的DNA衍生物加入到探針序列中，從而達到人工調(diào)控基因探針解鏈溫度的目的。 但目前人們對這類DNA衍生物的研究還不充分，對于它們不同的堿基類型，不同的取代位點，不同的組合方式，是如何影響互補雙鏈的解鏈溫度的，還沒有進行全面，深入地研究。 這里設計了一套實驗來研究錯配的類型，錯配的數(shù)量，錯配的位點對互補雜交雙鏈熱力學特

3、性的影響。同時，還研究了其它一些在芯片檢測中可能遇到的情況，如堿基缺失和插入，非等長鏈的雜交，含有靶標核酸與非靶標核酸混合溶液的檢測等等。 一、寡核酸序列材料與方法本文所用寡核酸樣品從寶生物工程(大連)有限公司和聯(lián)星生物工程有限公司訂制，所有的核酸樣品用pH為7.4的Tris-HCl緩沖液(NaCl溶度為0.1M)，稀釋至50μM，保存在-20℃冰箱中。 二、雜交及解鏈溫度的測定各取4μL的靶標和探針寡核酸溶液在室溫進行

4、雜交，并用緩沖液稀釋至200ml，使靶標和探針的溶度都為1μM。 本實驗用瓦里安公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(Cary 100)，在260nm下測量雜交雙鏈的吸收值，得到解鏈溫度。 三、溫度梯度PCR我們分別在上游引物的不同位置用與模板DNA錯配的堿基來進行替代，并在引物最佳退火溫度附近設計了5個溫度梯度，來檢測PCR擴增結果。 結果與討論: 1，不同的堿基錯配類型其穩(wěn)定性也各不相同。堿基對的穩(wěn)定性順序如下：

5、GT=GA)AA=TT>TC≥AC≥CC。 2，錯配發(fā)生的位置對核酸的穩(wěn)定性也有影響，當錯配堿基位于端點時，其穩(wěn)定性高于在中間位置的錯配。 3，堿基的插入與缺失降低了雜交雙鏈的穩(wěn)定性，堿基的插入和缺失在雙鏈中形成“泡”形結構，含有一個“泡”的雙鏈比含有一個錯配的雙鏈更穩(wěn)定。 4，雜交雙鏈形成“尾巴”結構時，雜交雙鏈親和力與“尾”部末段的堿基配對類型有關，GC穩(wěn)定性高，它出現(xiàn)在“尾”部末段時，降低了“尾巴”擺動對雜