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文檔簡介
1、RNA干擾(RNAi)是一種高效的序列特異性的基因沉默現(xiàn)象。1998年,F(xiàn)ire和Mello提出RNA干擾的理論,并因此獲得了2006年諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎。2001年,Tuschl等研究發(fā)現(xiàn)除長片段雙鏈RNA外,小干擾RNA(siRNA)同樣具有誘導(dǎo)基因沉默的功效,特別是在哺乳動物細胞中。雖然siRNA的強大的基因沉默功能使其在疾病治療領(lǐng)域擁有廣闊的前景,但其自身雙鏈RNA的性質(zhì)并不適合作為藥物分子。綜合分析siRNA作為藥物的不足之處
2、,作者認為首要解決的問題是穩(wěn)定性的提高,包括熱力學(xué)穩(wěn)定性和血清中穩(wěn)定性。其理念是穩(wěn)定性的提高有助于降低siRNA在治療中的藥物使用量,從而起到緩解免疫刺激反應(yīng)和脫靶效應(yīng)的作用。此外,藥物使用量的減小可以使導(dǎo)入活性的優(yōu)化更為簡便。
為實現(xiàn)siRNA穩(wěn)定性的提高,作者設(shè)計通過化學(xué)修飾在siRNA雙鏈的3'和5'位末端分別引入不同的反應(yīng)基團,再由不同反應(yīng)基團間的共價鍵交聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建雙端封閉的啞鈴型RNA。啞鈴型RNA不僅可有效抑制RN
3、A雙鏈的解旋,其非天然結(jié)構(gòu)的修飾末端還能阻止核酸外切酶的水解作用,最終達到提高siRNA穩(wěn)定性的目的。考慮到懸突結(jié)構(gòu)在核酶Dicer的切割過程中起定位作用,作者在實驗實施中還構(gòu)建了單端封閉的發(fā)卡型RNA。
在設(shè)計之初,作者選擇Cu(I)催化的疊氮化物和炔的Huisgen1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)構(gòu)建核酸交聯(lián)。但是,經(jīng)過多次實驗驗證,作者發(fā)現(xiàn)該方法會造成RNA的嚴重降解。經(jīng)總結(jié),Cu離子的氧化還原反應(yīng)造成了RNA的損傷。盡管有報道稱
4、引入Cu配體可緩解損傷,例如TBTA、THPTA等,但是由于損傷后的siRNA在體內(nèi)的作用靶點是未知的,伴隨siRNA的高沉默活性所造成的后果是難以預(yù)測的。因此,尋找非金屬催化的快速定量,條件溫和,且生物兼容性好的“點擊”化學(xué)反應(yīng),以實現(xiàn)RNA的交聯(lián)修飾,成為作者新的研究方向。
在尋找新型非金屬催化交聯(lián)反應(yīng)的過程中作者注意到了同實驗室易龍的工作——基于巰基邁克爾加成反應(yīng)的新型熒光探針。該新型熒光探針具有快速定量,條件溫和,選擇
5、性好等優(yōu)點,并已證明可成功應(yīng)用于RNA修飾。在探針工作的基礎(chǔ)上,作者設(shè)計合成了連接分子——對苯二馬來酰胺酸甲酯,希望通過其雙端與巰基的邁克爾加成反應(yīng),實現(xiàn)核酸的末端交聯(lián)。巰基的邁克爾加成反應(yīng)是一個理想的選擇,其原因有:(1)巰基修飾可通過固相合成儀引入核酸,還可通過半胱氨酸突變引入蛋白質(zhì);(2)反應(yīng)快速定量,反應(yīng)條件溫和,可在水相中進行;(3)生成的共價鍵連接產(chǎn)物穩(wěn)定性好,生物兼容性好。
在DNA交聯(lián)部分工作中,作者應(yīng)用巰基與
6、馬來酰胺酸甲酯間的邁克爾加成反應(yīng),成功實現(xiàn)了DNA的單雙末端交聯(lián)反應(yīng),構(gòu)建出了發(fā)卡型DNA(hpODN)和啞鈴型DNA(dbODN)。該新型非金屬催化交聯(lián)體系具有反應(yīng)快速,選擇性高,不會造成DNA損傷等優(yōu)點。所得交聯(lián)產(chǎn)物在不影響B(tài)型雙螺旋結(jié)構(gòu)的前提下,熱力學(xué)穩(wěn)定性得到顯著的改善,并可被限制性內(nèi)切酶識別切割。
在RNA交聯(lián)部分工作中,作者應(yīng)用巰基與馬來酰亞胺間的邁克爾加成反應(yīng),成功實現(xiàn)了RNA的單雙末端交聯(lián)反應(yīng),構(gòu)建出了發(fā)卡型R
7、NA(hpRNA)和啞鈴型RNA(dbRNA)。該新型非金屬催化交聯(lián)體系具有反應(yīng)快速,選擇性高,產(chǎn)物穩(wěn)定,且不會造成RNA損傷等優(yōu)點。所得交聯(lián)產(chǎn)物在不影響A型雙螺旋結(jié)構(gòu)的前提下,熱力學(xué)穩(wěn)定性和血清中穩(wěn)定性得到顯著的改善。修飾RNA可以被核酶Dicer識別切割,其RNA干擾活性與天然siRNA在同一水平,且具有更長的干擾活性時間。
siRNA穩(wěn)定性的提高是RNA干擾領(lǐng)域急需解決的問題。作者首次將巰基邁克爾加成反應(yīng)應(yīng)用于RNA的交
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