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文檔簡介
1、目的:構(gòu)建S6K1shRNA重組基因腺病毒(S6K1Ax)并在細(xì)胞及小鼠水平驗證對S6K1基因的沉默效果。將其注射到db/db小鼠尾靜脈內(nèi),觀察肝臟S6K1基因沉默后對db/db小鼠肝臟胰島素抵抗及脂肪肝的影響并分析其作用機制。
方法:設(shè)計3種S6K1shRNA基因序列,通過在pcPUR質(zhì)粒與pcDNA質(zhì)粒、cosmid質(zhì)粒之間的拼接將S6K1shRNA最后轉(zhuǎn)染進(jìn)腺病毒中,篩選出沉默效果最佳的重組基因腺病毒,并在293細(xì)胞
2、擴增純化得到高效價的病毒。在western blot水平檢測S6K1Ax轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞AML12后S6K1蛋白表達(dá),評價其基因沉默效果。將S6K1Ax注射進(jìn)C57BL/6J小鼠尾靜脈,用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot觀察小鼠肝臟S6K1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。將制備的S6K1Ax注射進(jìn)db/db小鼠尾靜脈,以注射pU6Ax的作為對照組,每組各6只,分別在第6日進(jìn)食及空腹?fàn)顟B(tài)時處死小鼠取肝臟,稱取肝臟重
3、量,HE染色觀察肝臟形態(tài),比色法測定肝臟甘油三酯含量。提取肝臟蛋白利用western blot方法檢測IRS1、IRS2及其酪氨酸蛋白的表達(dá),提取肝臟總RNA用逆轉(zhuǎn)錄PCR法觀察糖異生基因PGC1α、PEPCK、G6Pase mRNA及脂肪酸代謝基因PPARα、CPT-1、SREBP1c、FAS、SCD-1mRNA表達(dá)。病毒注射前后尾靜脈取血測定血糖、胰島素、FFA、、TG、TC、ALT等,胰島素測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),F(xiàn)
4、FA、TG、CHO、ALT測定采用比色法。
結(jié)果:制備的S6K1shRNA基因重組腺病毒可成功抑制小鼠AML12細(xì)胞的S6K1蛋白表達(dá),將S6K1Ax注射進(jìn)C57BL/6J小鼠尾靜脈,第6日處死小鼠取肝臟提取肝臟蛋白,在S6K1蛋白表達(dá)被完全抑制的情況下,實驗組mS6K154.7%表達(dá)被抑制(P<0.01)。與對照組相比,在進(jìn)食及空腹?fàn)顟B(tài)實驗組IRS1、IRS2的蛋白表達(dá)均增強,但I(xiàn)RS1、IRS2酪氨酸磷酸化水平只有在空
5、腹時才較對照組表達(dá)增強,進(jìn)食狀態(tài)兩組沒有差異。逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示在空腹?fàn)顟B(tài)下S6K1Ax注射組糖異生基因PGC1α、PEPCK、G6Pase mRNA均表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。血清測定顯示空腹血糖S6K1Ax注射組呈下降趨勢,但未有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),無論空腹及進(jìn)食狀態(tài)血清胰島素水平與對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),膽固醇均較對照組下降(P<0.01),F(xiàn)FA在空腹S6K1Ax注射組表現(xiàn)了下降,谷
6、丙轉(zhuǎn)氨酶ALT在各組均沒有差異。與對照組相比,S6K1Ax注射組小鼠脂肪肝明顯改善,肝臟占體重百分比下降(P<0.01),HE染色顯示S6K1Ax注射組小鼠肝臟細(xì)胞脂肪滴減少,肝臟甘油三酯含量降低,參與脂肪合成的基因mSREBP1c、mFAS、mSCD-1表達(dá)下降(P<0.01),脂肪酸氧化基因mPPARα、CPT-1表達(dá)也降低(P<0.01)。
結(jié)論:構(gòu)建的S6K1Ax可將小鼠肝細(xì)胞AML12細(xì)胞系及C57BL/6J小鼠
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