重組多肽CS5931的制備工藝優(yōu)化及體內(nèi)外抗結腸癌作用.pdf

1、目的：
　　對重組多肽CS5931的制備工藝進行優(yōu)化，并研究其體內(nèi)外抗結腸癌的作用，為將來的中試放大和藥理學研究提供依據(jù)和實驗基礎。
　　方法：
　　1.以 pET28a為載體質(zhì)粒，以大腸桿菌 BL21(DE3)為表達菌株，構建質(zhì)粒pET28a-CS5931和pET28a-DDDK-CS5931并分別轉(zhuǎn)化到表達菌株中，進行重組多肽CS5931和CS5931-EK的表達；將發(fā)酵所得菌體裂解后進行超聲破碎離心處理，利用鎳柱

2、親和層析法、使用儀器AKTA-Purifier100進行多肽的分離純化；利用SDS-PAGE和Western blot法檢測重組多肽CS5931和CS5931-EK的表達。
　　2.以大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-CS5931為發(fā)酵菌株，從碳源、氮源、磷酸鹽、Mg2+、誘導劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）的濃度、誘導溫度、誘導時間等方面優(yōu)化表達體系的發(fā)酵制備工藝。利用Plackett-Burman實驗篩選

3、出對重組多肽CS5931的表達影響最大的3個因素，并結合單因素實驗結果設計響應面實驗，通過中心組和實驗（CCD）結果篩選出3個因素的最佳組合。
　　3.利用單因素實驗優(yōu)化復性液成分，包括小分子物質(zhì)甘油、尿素和谷胱甘肽，并檢測了利用優(yōu)化后的復性液進行復性所制備重組多肽 CS5931的表達量及抗結腸癌細胞HCT116增殖的活性。
　　4.利用MTT法評價重組薩氏海鞘多肽 CS5931和CS5931-EK對體外結腸癌細胞HCT11

4、6的增殖抑制作用。建立人結腸癌細胞HCT116裸鼠移植瘤模型，并利用該模型考察重組薩氏海鞘多肽CS5931的體內(nèi)抗結腸癌作用。
　　結果：
　　1.成功構建了pET28a/CS5931質(zhì)粒和pET28a-DDDK-CS5931質(zhì)粒并表達了重組多肽CS5931和CS5931-EK。重組多肽CS5931經(jīng)分離純化后呈單一條帶，且純度可達到98％。重組多肽CS5931和CS5931-EK的表達量分別為每升發(fā)酵液2.0 mg和1.5

5、 mg。
　　2.發(fā)酵制備工藝優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為酵母提取物濃度30 g/L，甘油濃度0.45%，IPTG濃度0.75 mM，誘導溫度16℃，誘導時間20 h。優(yōu)化后重組多肽CS5931的表達量從2.0 mg/L提高到7.5 mg/L，與優(yōu)化前相比提高了2.75倍。
　　3.優(yōu)化后的復性液能夠顯著提高重組多肽CS5931的抗結腸癌細胞HCT116增殖的活性，對人結腸癌細胞HCT116的半數(shù)抑制濃度IC50值從23.2μM下

6、降到11.6μM（活性增強1倍）。優(yōu)化后復性液組分確定為50 mM Tris，0.5 mM EDTA，50 mM NaCl，0.5 mM L-精氨酸，5%甘油，2 M尿素和2 mM/0.2 mM GSH/GSSH。
　　4.所制備的重組多肽CS5931和CS5931-EK都具有顯著的體外抗結腸癌細胞增殖的活性，His-tag的有無對重組多肽的抗結腸癌作用沒有明顯影響。體內(nèi)實驗表明重組多肽CS5931在25 mg/kg劑量時顯著抑制

7、人結腸癌HCT116裸鼠移植瘤的生長，且抗癌效果呈劑量依賴性，在同劑量（50 mg/kg）下抗癌效果優(yōu)于陽性對照藥環(huán)磷酰胺（CTX），同時用藥期間未發(fā)現(xiàn)動物死亡，顯示該重組多肽具有一定的安全性。
　　結論：
　　1.通過單因素實驗，Plackett-Burman實驗和中心組和實驗對重組多肽 CS5931的制備工藝進行了優(yōu)化。使用優(yōu)化后的工藝制備重組多肽CS5931，表達量從2.0 mg/L提高到7.5 mg/L，與優(yōu)化前相比