甲氨蝶呤納米靶向緩釋系統(tǒng)的制備及體內(nèi)外抗腫瘤作用研究.pdf

1、癌癥納米療法的迅速發(fā)展，解決了傳統(tǒng)藥物遞送系統(tǒng)的選擇性低、毒性大和耐藥性等問題。研究高效的納米靶向制劑是解決這些問題的關(guān)鍵課題，已受到生物醫(yī)學(xué)及材料科學(xué)研究者的極大關(guān)注和興趣。而腫瘤生長分子機制的揭示，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞與正常細胞的結(jié)構(gòu)差異性，使得腫瘤細胞特有的分子靶點成為抗腫瘤藥物研究和開發(fā)的熱點。
　　本論文以提高藥物的靶向性和延長其在血液中的循環(huán)時間為研究目的，制備了以殼聚糖(Chitosan，CS)和甲氧基聚乙二醇(Methox

2、y polyethylene glycol，mPEG)為載體的甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX))納米靶向緩釋系統(tǒng)，并研究其在體內(nèi)外抗腫瘤作用。首先，對該MTX納米體系進行結(jié)構(gòu)表征和取代度、包封率、載藥量測定。其次，建立葉酸受體(FR)高表達的細胞和動物模型，評價其體內(nèi)外細胞攝取和抗腫瘤活性。再次，創(chuàng)新性選擇了培美曲塞(Pemetrexed，PEM)作為抗葉酸代謝藥，構(gòu)建了新型雙載藥多靶點的MTX納米體系，并系統(tǒng)評價該體系在葉

3、酸受體(FR)低表達的細胞和動物模型中的抗腫瘤療效。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)采用分子量約為7萬的殼聚糖(Chitosan，CS)為納米載體原材料，通過三聚磷酸鈉(Sodium Tripolyphosphate，STPP)和戊二醛(Glutaraldehyde，GA)的物理誘導(dǎo)及化學(xué)交聯(lián)作用制備粒徑可控、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的納米粒。通過正交實驗的多水平多因子分析獲得的優(yōu)化制備條件是:MCS∶MSTPP=5∶1，pH值為4.0，STPP滴

4、速為1 mL/min，反應(yīng)溫度10℃。在上述條件下引入親水性基團-mPEG，增加納米載體的水溶性和緩釋性。在乙基[3-（二甲胺基）丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC)催化下成功將MTX、FA、PEM偶聯(lián)到mPEG化的納米載體上。
　　(2)通過激光散射粒度分析儀(DLS)測得納米粒平均粒徑在165 nm左右，PDI

5、小于0.2。納米粒子分布圖表明粒徑分布較窄，Zeta電位45 mV左右。電鏡觀察顯示，粒子呈單分散狀態(tài)，球形，其表面光滑。PEG增加了CS-NPs的水溶性，降低CS本身的粘性。采用傅立葉紅外光譜、核磁共振波譜等分析儀器對MTX-mPEG-CS-NPs的結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果表明mPEG和MTX都成功地偶聯(lián)到CS上，每個CS-NPs中結(jié)合了99個mPEG和1562個MTX。紫外可見分光光度法測得MTX-mPEG-CS-NPs的載藥量和包封率分

6、別為44.26±0.64％和87.36±0.79％。由此可見，納米粒尺寸可控、性能穩(wěn)定，滿足納米粒載藥體系的要求。
　　(3)MTX-mPEG-CS-NPs和MTX-PEM-mPEG-CS-NPs在不同pH介質(zhì)下的體外釋放實驗表明，MTX在堿性條件更有利于藥物的釋放，并呈現(xiàn)突釋和緩釋的雙相釋放特征。在37℃時，藥物釋放在144 h僅7％，說明該方法可制得性質(zhì)穩(wěn)定、緩釋的單載藥及雙載藥納米體系。
　　(4)對甲氨蝶呤殼聚糖納米

7、粒進行藥物敏感性試驗，發(fā)現(xiàn)使用MTX-mPEG-CS-NPs比單純使用MTX對腫瘤細胞增殖的抑制率高。流式細胞技術(shù)分析了載藥納米粒對細胞的增值抑制率，發(fā)現(xiàn)載藥納米粒對宮頸癌(HeLa)細胞增殖的抑制明顯作用優(yōu)于純藥物。小鼠肝癌(H22)體內(nèi)的光學(xué)成像結(jié)果表明，MTX從納米粒中釋放后靶向分布到腫瘤組織中，表現(xiàn)出顯著的腫瘤滯留作用和選擇性，以及MTX納米體系的葉酸通路的自靶向性。這些結(jié)果表明，MTX-mPEG-CS-NPs有望成為靶向抗腫瘤

8、化療藥，尤其對葉酸受體高表達的腫瘤。
　　(5)雙載藥體系MTX-PEM-mPEG-CS-NPs的細胞和動物試驗結(jié)果顯示，雙載藥納米粒對人肺癌(A549)作用24 h后抑制率分別為純藥和單載藥的1.5倍和1.3倍;PEM-MTX-mPEG-CS-NPs對A549作用72 h的半抑制濃度(IC50)為0.76μg/mL;PEM-MTX-mPEG-CS-NPs對荷鼠肺癌(LLC)的C57小黑鼠給藥25 d的抑瘤率為80.66±1.99