薩氏海鞘多肽CS5931的發(fā)酵和純化條件優(yōu)化及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、玻璃海鞘廣泛分布于山東沿海地區(qū)，曾是水產(chǎn)養(yǎng)殖的大敵，但它是發(fā)育與進(jìn)化生物學(xué)研究的重要生物，且近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、免疫調(diào)節(jié)以及生物催化等作用，因而引起人們廣泛關(guān)注。玻璃海鞘具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，因此被《Science》雜志稱(chēng)為生物學(xué)研究的后起之秀，具有良好的應(yīng)用前景。
　　從薩氏海鞘（Ciona savignyi）中分離出的一種新型多肽CS5931具有顯著的抗腫瘤活性，N-末端序列分析發(fā)現(xiàn)，CS5931與人顆

2、粒體蛋白（granulin，GRN）有同源性。本課題組已成功通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組薩氏海鞘多肽CS5931，其同樣具有顯著的抗腫瘤活性。
　　本研究以重組表達(dá)薩氏海鞘多肽CS5931的大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CS5931為考察菌株，從IPTG的濃度、IPTG添加時(shí)間、誘導(dǎo)時(shí)間、接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度等方面優(yōu)化表達(dá)體系的發(fā)酵條件。利用PB實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)發(fā)酵條件影響最大的3個(gè)因素，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面

3、實(shí)驗(yàn)，最后通過(guò)CCD實(shí)驗(yàn)確定3個(gè)主要因素的最優(yōu)值。發(fā)酵條件優(yōu)化后表達(dá)收率達(dá)0.703g/L，與優(yōu)化前相比提高了2.01倍。
　　將發(fā)酵生產(chǎn)的菌種超聲破碎離心處理后，利用AKTA-Purifier過(guò)鎳柱進(jìn)行分離純化。改變分離純化過(guò)程中的緩沖液種類(lèi)、高鹽濃度，變復(fù)性過(guò)程中的變復(fù)性方式、緩沖液種類(lèi)等條件，達(dá)到優(yōu)化目的。優(yōu)化后蛋白收率達(dá)30％，基本完成預(yù)期目標(biāo)。
　　通過(guò)MTT法評(píng)價(jià)了重組薩氏海鞘多肽CS5931對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

4、作用。結(jié)果表明，CS5931對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、人胰腺癌細(xì)胞Panc28、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460、人肝癌細(xì)胞BEL-7402等均有增殖抑制作用，IC50值分別為1.41、2.04、4.28、11.71μM，而其對(duì)正常細(xì)胞HFL1的抑制作用比腫瘤細(xì)胞弱，其IC50值約為28μM。
　　通過(guò)對(duì)重組薩氏海鞘多肽CS5931的發(fā)酵條件及分離純化條件的優(yōu)化，得到了較高的多肽收率，并且重組多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較好的抑制活性，為