香附四物湯揮發(fā)油部位的化學(xué)成分分析與香附藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究.pdf

1、本論文來自于江蘇省高校自然科學(xué)重大基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目“四物湯類方治療婦科血瘀證的物質(zhì)基礎(chǔ)和配伍機(jī)理研究”。香附四物湯是四物湯的重要衍化方之一，臨床主要用于氣滯血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的治療。本論文首先對(duì)香附四物湯的效應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行了初步篩選，采用縮宮素誘導(dǎo)的小鼠離體子宮模型篩選香附四物湯治療婦科血瘀證痛經(jīng)的活性部位，結(jié)果顯示揮發(fā)油等部位的活性顯著。本論文主要對(duì)香附四物湯揮發(fā)油部位開展相關(guān)研究；此外，對(duì)香附四物湯的重要組方藥味—香附進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

2、
　　 一、香附四物湯治療婦科血瘀證痛經(jīng)的活性部位篩選
　　 采用縮宮素誘導(dǎo)的小鼠離體子宮模型篩選香附四物湯治療婦科血瘀證痛經(jīng)的活性部位。結(jié)果表明：揮發(fā)油部位(xf-1)、醇沉后上清液(xf-5)、60％乙醇洗脫液(xf-13)、70％乙醇洗脫液(xf-14)對(duì)小鼠離體子宮的收縮幅度和平均肌張力具有非常顯著的抑制作用，因此，揮發(fā)油部位等可能是香附四物湯的治療婦科血瘀證的重要活性部位。
　　 為了尋找香附四物湯揮發(fā)

3、油的活性來源及其與基本方的活性差異，進(jìn)一步對(duì)四物湯揮發(fā)油、香附四物湯揮發(fā)油、組方藥咪揮發(fā)油及香附四物湯揮發(fā)油主要成分藁本內(nèi)酯的抑制小鼠離體子宮收縮活性進(jìn)行比較。結(jié)果：香附四物湯揮發(fā)油對(duì)小鼠離體子宮的收縮幅度和平均肌張力具有非常顯著抑制作用；四物湯揮發(fā)油對(duì)小鼠離體子宮的收縮頻率具有顯著抑制作用；組方藥味當(dāng)歸、川芎揮發(fā)油對(duì)小鼠離體子宮的收縮頻率和幅度具有顯著抑制作用，而香附和木香揮發(fā)油對(duì)頻率、幅度和平均肌張力具有顯著抑制作用；藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠

4、離體子宮的收縮頻率和平均肌張力有顯著抑制作用。結(jié)論：香附四物湯揮發(fā)油部位具有顯著抑制子宮平滑肌收縮的效應(yīng)，香附四物湯揮發(fā)油活性優(yōu)于四物湯及各組方藥味揮發(fā)油，其中作為行氣、止痛、調(diào)經(jīng)常用藥味香附、木香揮發(fā)油抑制小鼠離體子宮收縮的活性顯著，可能是香附四物湯治療氣滯血瘀證痛經(jīng)的重要配方藥味；藁本內(nèi)酯可能是香附四物湯揮發(fā)油中的重要活性成分之一。
　　 二、香附四物湯及組方藥味揮發(fā)油的GC-MS分析
　　 采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)鑒

5、定了香附四物湯揮發(fā)油中35個(gè)主要化合物，已鑒定成分占揮發(fā)油總量的86.61％。其中主要成分有：藁本內(nèi)酯(42.39％)，β-芹子烯(4.49％)，α-香附酮(4.33％)，β-香附酮(2.57％)，香附烯(1.87％)，丁烯基酜內(nèi)酯(3.40％)，1，3-環(huán)辛二烯(3.75％)，去氫木香內(nèi)酯(1.92％)等。同時(shí)鑒定了四物湯揮發(fā)油中的29個(gè)主要化合物，約占揮發(fā)油總量的72.90％；鑒定了當(dāng)歸藥材揮發(fā)油中的30個(gè)主要化合物，占當(dāng)歸揮發(fā)油總

6、量的72.90％；鑒定川芎揮發(fā)油中36個(gè)組分，占川芎揮發(fā)油總量的78.30％；鑒定香附揮發(fā)油中28個(gè)組分，占香附揮發(fā)油總量的89.42％；鑒定木香揮發(fā)油中35個(gè)組分，占揮發(fā)油總量的69.54％。四物湯、香附四物湯揮發(fā)油GC-MS總離子流圖的化學(xué)信號(hào)主要源于當(dāng)歸、川芎藥材。香附四物湯揮發(fā)油中對(duì)應(yīng)于香附、木香藥材揮發(fā)性成分的信號(hào)數(shù)及強(qiáng)度均不及在各自藥材揮發(fā)油中的表現(xiàn)，可能是由于組方配比用量降低了香附和木香藥材揮發(fā)油的化學(xué)成分信號(hào)，或由于復(fù)方

7、提取時(shí)部分成分的蒸餾效率降低，或發(fā)生成分轉(zhuǎn)化。
　　 通過對(duì)比香附四物湯與組方藥材揮發(fā)油的化學(xué)成分組成，發(fā)現(xiàn)復(fù)方中基本保留了單味藥材的主要成分，但也并非簡單相加，在成分種類和相對(duì)含量上存在差異。如復(fù)方揮發(fā)油中檢測(cè)到的菠菜烯(Squalene)在單味藥材揮發(fā)油中未檢出，為復(fù)方配伍后新出現(xiàn)的成分；而單味藥材揮發(fā)油中含有的正十四烷(Tetradecane)，十六烷酸(Hexadecanoic acid)，氧化石竹烯(Caryophyl

8、lene oxide)、諾卡酮(Nootkatone)、7-甲基-3，4-辛二烯(7-Methyl-3，4-octadiene)、香檸檬醇(Bergamotol)、α-姜黃烯(α-Curcumene)等成分在復(fù)方揮發(fā)油中消失。以上結(jié)果說明了香附四物湯各配方藥味組成復(fù)方作為整體提取時(shí)，提出的揮發(fā)油會(huì)有新成分產(chǎn)生也有部分成分的含量降低，甚至未檢測(cè)出。
　　 三、香附四物湯揮發(fā)性成分與子宮平滑肌收縮效應(yīng)的相關(guān)性分析
　　 采用

9、主成分分析(PCA)法，對(duì)香附四物湯及組方藥材揮發(fā)油中含量高于1％的化學(xué)成分(53個(gè))與抑制小鼠離體子宮收縮的生物效應(yīng)建立多變量數(shù)學(xué)模型，對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果：PCA分析表明有21個(gè)化學(xué)成分對(duì)活性貢獻(xiàn)率較大，其中對(duì)四物湯揮發(fā)油活性貢獻(xiàn)率較大的成分主要有：Z-藁本內(nèi)酯(Z-Ligustilide)、順式羅勒烯(cis-Ocimene)、γ-芹子烯(γ-Selinene)、匙葉桉油烯醇(Spathulenol)、3-丁烯基苯酞(3-Bu

10、tylidene phathalide)、E-藁本內(nèi)酯(E-Ligustilide)等；對(duì)香附四物湯揮發(fā)油活性貢獻(xiàn)率較大的成分主要有：去氫木香內(nèi)酯(Dehydrocostuslactone)、香附烯(Cyperene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、γ-芹子烯(γ-Selinene)、姜黃烯(Curcumene)、α-欖香烯(α-Elemene)、β-香附酮(β-Cyperone)、α-香附酮(α-Cyperone)、Z

11、-藁本內(nèi)酯(Z-Ligustilide)、菠菜烯(Squalene)等。結(jié)論：與四物湯相比，香附四物湯
　　中活性貢獻(xiàn)較大的揮發(fā)性成分主要源于行氣、止痛常用藥材木香和香附的揮發(fā)性成分，如去氫木香內(nèi)酯、香附烯、β-香附酮、α-香附酮等，這兩味藥的揮發(fā)性成分可能與香附四物湯揮發(fā)油部位治療氣滯血瘀證痛經(jīng)密切相關(guān)。
　　 四、香附四物湯揮發(fā)油的提取工藝與β-環(huán)糊精包合工藝的研究
　　 采用水蒸氣蒸餾法提取香附四物湯揮發(fā)油

12、，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)選，最佳提取工藝為：藥材當(dāng)歸、川芎、香附、木香分別粉碎過10目篩，與其他藥材按比例組方，加10倍量水，浸泡1h，提取時(shí)間6h，香附四物湯揮發(fā)油得率約為0.4％。
　　 為了增加香附四物湯揮發(fā)油的穩(wěn)定性及便于保存和應(yīng)用，采用β-環(huán)糊精包合技術(shù)包合香附四物湯揮發(fā)油。正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳包合工藝為：β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的比例為8:1，溫度50℃，包合時(shí)間為3h。采用TLC和UV光譜掃描的方法驗(yàn)證了揮發(fā)油包合物的形成。采用GC

13、-MS法對(duì)香附四物湯揮發(fā)油包合前后的成分組成進(jìn)行考察，結(jié)果包合前后揮發(fā)油的總離子流圖(TIC)與化學(xué)成分組成基本相同，說明β-環(huán)糊精對(duì)香附四物湯揮發(fā)油的包合不會(huì)引起揮發(fā)油成分組成的變化。
　　 五、香附四物湯揮發(fā)油的質(zhì)量控制研究
　　 建立了香附四物湯揮發(fā)油與組方藥材揮發(fā)油的TLC鑒別方法和主要活性成分藁本內(nèi)酯、α-香附酮、去氫木香內(nèi)酯的HPLC含量測(cè)定方法。結(jié)果表明，在不同的展開系統(tǒng)下，香附四物湯揮發(fā)油的TLC試驗(yàn)中均

14、檢出與組方藥味揮發(fā)油對(duì)應(yīng)的主要斑點(diǎn)，如藁本內(nèi)酯、α-香附酮、去氫木香內(nèi)酯；建立了香附四物湯揮發(fā)油藁本內(nèi)酯、α-香附酮和去氫木香內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，測(cè)定結(jié)果為，香附四物湯揮發(fā)油中藁本內(nèi)酯、α-香附酮、去氫木香內(nèi)酯含量分別為49.28％、1.68％和1.75％，經(jīng)六批香附四物湯揮發(fā)油的樣品測(cè)定，三種成分含量的RSD％均在5％以內(nèi)。
　　 六、香附藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究
　　 香附為香附四物湯中的重要組方藥味，本文對(duì)不同產(chǎn)地來源的

15、香附藥材質(zhì)量進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)研究。收集國內(nèi)產(chǎn)量較大的8個(gè)產(chǎn)地的香附——山東泰安、河南開封、安徽亳州、江蘇常州、浙江磐安、廣西玉林、海南昌江、河北安國香附，對(duì)其性狀特征、揮發(fā)油含量、揮發(fā)油的化學(xué)成分組成以及抗炎活性部位甲醇提取物進(jìn)行了比較和聚類分析。結(jié)果：(1)山東泰安產(chǎn)香附(地道產(chǎn)區(qū))顆粒飽滿，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，氣芳香，從性狀上表現(xiàn)較佳；8個(gè)產(chǎn)地的香附藥材中以山東泰安香附的揮發(fā)油含量最高(1.25％)。(2) GC-MS法鑒定了8個(gè)產(chǎn)地香附藥材揮

16、發(fā)油中的22個(gè)主要化學(xué)成分，如香附烯(Cyperene)、β-芹子烯(β-Selinene)、α-香附酮(α-Cyperone)、Aristol-9-en-3-one、β-香附酮(β-Cyperone)等。其中有效成分α-香附酮在8個(gè)產(chǎn)地香附藥材揮發(fā)油中的相對(duì)含量：河北安國>河南開封>浙江磐安>廣西玉林>海南昌江>江蘇常州>安徽亳州>山東泰安；香附烯的相對(duì)含量：江蘇常州>山東泰安>浙江磐安>安徽亳州>海南昌江>河南開封>河北安國。傳統(tǒng)地

17、道藥材山東產(chǎn)香附揮發(fā)油中α-香附酮、香附烯的含量并非最高，該結(jié)果提示香附地道藥材的內(nèi)涵并非體現(xiàn)在某幾個(gè)活性成分的含量，可能是多組分的有機(jī)組合。(3)HPLC-DAD法分析了8個(gè)產(chǎn)地香附藥材甲醇提取物的色譜信息。以254nm下的信號(hào)最為豐富，在該波長下，對(duì)主要信號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明安徽亳州、浙江磐安和海南昌江香附的化學(xué)成分信息與山東泰安香附表現(xiàn)出較好的趨同性，而河北安國與山東泰安香附距離最遠(yuǎn)，表現(xiàn)出明顯的趨異性。<