腎陽(yáng)虛對(duì)消化吸收功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:本課題立足腎脾相關(guān)理論，以脾陽(yáng)根于腎陽(yáng)為切入點(diǎn)，以雙側(cè)腎上腺大部切除術(shù)建立腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型為平臺(tái)，觀察模型大鼠的消化吸收功能，圍繞血清GAS、血清D-木糖含量，探討細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)與腎陽(yáng)虛影響消化吸收功能的相關(guān)機(jī)制，并觀察參附湯對(duì)腎陽(yáng)虛證模型大鼠消化吸收指標(biāo)的影響。運(yùn)用現(xiàn)代研究手段檢測(cè)胃竇粘膜組織、小腸粘膜吸收細(xì)胞的凋亡率，胃竇粘膜組織G細(xì)胞的表達(dá)及G細(xì)胞表達(dá)Caspase-3的百

2、分率，小腸粘膜吸收細(xì)胞的Bcl-2、Bax表達(dá)及其超微病理形態(tài)等消化吸收相關(guān)指標(biāo)，旨在從分子基因水平初步探討腎陽(yáng)虛影響消化吸收功能的可能機(jī)制。
　　 方法:本課題采用8周齡雄性SD大鼠，以雙側(cè)腎上腺大部切除方法建立腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型，并設(shè)假手術(shù)組作為對(duì)照。術(shù)后4周，將手術(shù)大鼠隨機(jī)分為模型組和參附湯組。參附湯組大鼠于每天上午8:30灌胃給予參附湯水煎液（藥物濃度為每ml藥液含生藥0.5g）1.6ml/200g體重，假手術(shù)組和模型組均

3、灌胃給予等容量的生理鹽水。共4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠體溫，收集24小時(shí)尿液，采集血液，留取胃竇粘膜組織及小腸粘膜組織，分離、收集小腸粘膜吸收細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè):①檢測(cè)24小時(shí)尿17-OH-CS含量;②檢測(cè)血清GAS、D-木糖含量;③觀察胃竇粘膜組織、小腸粘膜組織顯微結(jié)構(gòu)改變;④觀察小腸粘膜吸收細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變;⑤TUNEL法檢測(cè)胃竇粘膜組織凋亡率、免疫組化法檢測(cè)G細(xì)胞表達(dá)的平均光密度值及免疫組化雙染法檢測(cè)G細(xì)胞表達(dá)Caspas

4、e-3的百分率;⑥取小腸粘膜吸收細(xì)胞單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小腸粘膜吸收細(xì)胞的凋亡率;⑦免疫組化法檢測(cè)小腸粘膜吸收細(xì)胞的Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的平均光密度。
　　 結(jié)果:
　　 ①體溫、24小時(shí)尿液指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠體溫、尿17-OH-CS含量顯著降低（P＜0.01）;與模型組比較，參附湯組大鼠體溫、尿17-OH-CS含量均顯著升高（P＜0.01）。
　　 ②血清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:與假手

5、術(shù)組比較，模型組大鼠血清GAS、D-木糖含量均顯著降低（P＜0.01）;與模型組比較，參附湯組大鼠血清GAS、D-木糖含量均顯著升高（P＜0.01）。
　　 ③胃竇粘膜組織指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的胃竇粘膜組織變薄，細(xì)胞間隙變大，粘膜腺體有不同程度的排列紊亂、疏松、出現(xiàn)大量空泡樣變;與模型組比較，參附湯組大鼠的胃竇粘膜組織稍厚，細(xì)胞間隙變小，腺細(xì)胞排列較規(guī)則，空泡樣變減少。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠胃竇粘膜組織的

6、凋亡率、G細(xì)胞表達(dá)Caspase-3的百分率顯著升高（P＜0.01），G細(xì)胞表達(dá)的平均光密度值顯著降低（P＜0.01）;與模型組比較，參附湯組大鼠胃竇粘膜組織的凋亡率、G細(xì)胞表達(dá)Caspase-3的百分率顯著下降（P＜0.01），G細(xì)胞表達(dá)的平均光密度值顯著升高(P＜0.01)。
　　 ④小腸粘膜組織指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:光鏡結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠小腸粘膜組織厚度略欠均勻，絨毛邊緣不整齊，部分上皮細(xì)胞脫落、缺失;與模型組比

7、較，參附湯組大鼠小腸粘膜組織厚度較均勻，絨毛排列規(guī)則，上皮基本完整。電鏡結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠小腸粘膜吸收細(xì)胞微絨毛略顯稀疏，細(xì)胞間連接疏松，細(xì)胞器模糊，細(xì)胞核膜內(nèi)陷，異染色質(zhì)凝聚、邊集，胞質(zhì)內(nèi)空泡多見(jiàn);參附湯組大鼠小腸粘膜吸收細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)較模型組情況有顯著改善，細(xì)胞間連接比較緊密，胞質(zhì)內(nèi)空泡化結(jié)構(gòu)少見(jiàn)，異染色質(zhì)凝集、邊集及核膜內(nèi)陷現(xiàn)象均較模型組好轉(zhuǎn)。免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠小腸粘膜組織吸收細(xì)胞Bcl-

8、2、Bax蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）;與模型組比較，參附湯組大鼠小腸粘膜組織吸收細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.01），Bax蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。
　　 ⑤小腸粘膜吸收細(xì)胞指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠小腸粘膜組織吸收細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01）;與模型組比較，參附湯組大鼠小腸粘膜組織吸收細(xì)胞的凋亡率顯著降低（P＜0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 ①采用腎上腺大

9、部切除法建立腎陽(yáng)虛證大鼠模型，模型組大鼠的一般表現(xiàn)符合腎陽(yáng)虛的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且模型組大鼠體溫、24小時(shí)尿17-OH-CS含量均顯著下降，說(shuō)明腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型建立成功。
　　 ②模型組大鼠血清GAS、D-木糖含量較假手術(shù)組顯著下降，說(shuō)明腎陽(yáng)虛證模型動(dòng)物的消化吸收功能下降。
　　 ③模型組大鼠胃竇粘膜組織的凋亡率、G細(xì)胞表達(dá)Caspase-3的百分率顯著升高，G細(xì)胞表達(dá)的平均光密度值顯著降低，說(shuō)明胃竇粘膜組織及其G細(xì)胞的過(guò)度凋亡

10、影響了GAS的分泌，進(jìn)而影響了模型大鼠的消化功能。
　　 ④模型組大鼠小腸粘膜吸收細(xì)胞的超微組織結(jié)構(gòu)改變符合凋亡細(xì)胞的典型表現(xiàn)，吸收細(xì)胞的凋亡率明顯升高，同時(shí)，小腸吸收細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，凋亡明顯，凋亡與增殖失衡，使小腸粘膜吸收細(xì)胞凋亡增加，增殖不足，得不到及時(shí)更新，從而影響了模型大鼠的吸收功能。
　　 ⑤溫補(bǔ)腎陽(yáng)方藥—參附湯可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)，從而抑制消化吸收相關(guān)

11、組織細(xì)胞的過(guò)度凋亡，促進(jìn)其更新，維護(hù)其功能，從而改善腎陽(yáng)虛證模型大鼠的消化吸收功能。
　　 本課題首次采用雙側(cè)腎上腺大部切除的方法建立腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型，率先運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)方法研究腎陽(yáng)虛影響消化吸收功能的相關(guān)機(jī)制。腎陽(yáng)虛證模型大鼠胃竇粘膜組織G細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3的表達(dá)顯著增強(qiáng)，小腸粘膜吸收細(xì)胞的促凋亡基因Bax表達(dá)顯著增強(qiáng)，使模型大鼠消化吸收相關(guān)組織細(xì)胞凋亡增加，功能受損，進(jìn)而表現(xiàn)為消化吸收功能下降。溫補(bǔ)腎陽(yáng)方藥—參