腎陽虛對消化吸收功能的影響及其機制研究.pdf

1、目的:本課題立足腎脾相關理論，以脾陽根于腎陽為切入點，以雙側腎上腺大部切除術建立腎陽虛證動物模型為平臺，觀察模型大鼠的消化吸收功能，圍繞血清GAS、血清D-木糖含量，探討細胞凋亡及凋亡相關蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達與腎陽虛影響消化吸收功能的相關機制，并觀察參附湯對腎陽虛證模型大鼠消化吸收指標的影響。運用現(xiàn)代研究手段檢測胃竇粘膜組織、小腸粘膜吸收細胞的凋亡率，胃竇粘膜組織G細胞的表達及G細胞表達Caspase-3的百

2、分率，小腸粘膜吸收細胞的Bcl-2、Bax表達及其超微病理形態(tài)等消化吸收相關指標，旨在從分子基因水平初步探討腎陽虛影響消化吸收功能的可能機制。
　　 方法:本課題采用8周齡雄性SD大鼠，以雙側腎上腺大部切除方法建立腎陽虛證動物模型，并設假手術組作為對照。術后4周，將手術大鼠隨機分為模型組和參附湯組。參附湯組大鼠于每天上午8:30灌胃給予參附湯水煎液（藥物濃度為每ml藥液含生藥0.5g）1.6ml/200g體重，假手術組和模型組均

3、灌胃給予等容量的生理鹽水。共4周。實驗結束時，測定實驗大鼠體溫，收集24小時尿液，采集血液，留取胃竇粘膜組織及小腸粘膜組織，分離、收集小腸粘膜吸收細胞進行相關指標檢測:①檢測24小時尿17-OH-CS含量;②檢測血清GAS、D-木糖含量;③觀察胃竇粘膜組織、小腸粘膜組織顯微結構改變;④觀察小腸粘膜吸收細胞的超微結構改變;⑤TUNEL法檢測胃竇粘膜組織凋亡率、免疫組化法檢測G細胞表達的平均光密度值及免疫組化雙染法檢測G細胞表達Caspas

4、e-3的百分率;⑥取小腸粘膜吸收細胞單細胞懸液，用流式細胞儀檢測小腸粘膜吸收細胞的凋亡率;⑦免疫組化法檢測小腸粘膜吸收細胞的Bcl-2、Bax蛋白表達的平均光密度。
　　 結果:
　　 ①體溫、24小時尿液指標檢測結果:與假手術組比較，模型組大鼠體溫、尿17-OH-CS含量顯著降低（P＜0.01）;與模型組比較，參附湯組大鼠體溫、尿17-OH-CS含量均顯著升高（P＜0.01）。
　　 ②血清指標檢測結果:與假手

5、術組比較，模型組大鼠血清GAS、D-木糖含量均顯著降低（P＜0.01）;與模型組比較，參附湯組大鼠血清GAS、D-木糖含量均顯著升高（P＜0.01）。
　　 ③胃竇粘膜組織指標檢測結果:與假手術組比較，模型組大鼠的胃竇粘膜組織變薄，細胞間隙變大，粘膜腺體有不同程度的排列紊亂、疏松、出現(xiàn)大量空泡樣變;與模型組比較，參附湯組大鼠的胃竇粘膜組織稍厚，細胞間隙變小，腺細胞排列較規(guī)則，空泡樣變減少。與假手術組比較，模型組大鼠胃竇粘膜組織的

6、凋亡率、G細胞表達Caspase-3的百分率顯著升高（P＜0.01），G細胞表達的平均光密度值顯著降低（P＜0.01）;與模型組比較，參附湯組大鼠胃竇粘膜組織的凋亡率、G細胞表達Caspase-3的百分率顯著下降（P＜0.01），G細胞表達的平均光密度值顯著升高(P＜0.01)。
　　 ④小腸粘膜組織指標檢測結果:光鏡結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠小腸粘膜組織厚度略欠均勻，絨毛邊緣不整齊，部分上皮細胞脫落、缺失;與模型組比

7、較，參附湯組大鼠小腸粘膜組織厚度較均勻，絨毛排列規(guī)則，上皮基本完整。電鏡結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠小腸粘膜吸收細胞微絨毛略顯稀疏，細胞間連接疏松，細胞器模糊，細胞核膜內(nèi)陷，異染色質凝聚、邊集，胞質內(nèi)空泡多見;參附湯組大鼠小腸粘膜吸收細胞超微結構較模型組情況有顯著改善，細胞間連接比較緊密，胞質內(nèi)空泡化結構少見，異染色質凝集、邊集及核膜內(nèi)陷現(xiàn)象均較模型組好轉。免疫組化結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠小腸粘膜組織吸收細胞Bcl-

8、2、Bax蛋白表達均顯著升高（P＜0.01）;與模型組比較，參附湯組大鼠小腸粘膜組織吸收細胞Bcl-2蛋白的表達顯著升高（P＜0.01），Bax蛋白的表達顯著降低（P＜0.01）。
　　 ⑤小腸粘膜吸收細胞指標檢測結果:與假手術組比較，模型組大鼠小腸粘膜組織吸收細胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01）;與模型組比較，參附湯組大鼠小腸粘膜組織吸收細胞的凋亡率顯著降低（P＜0.01）。
　　 結論:
　　 ①采用腎上腺大

9、部切除法建立腎陽虛證大鼠模型，模型組大鼠的一般表現(xiàn)符合腎陽虛的診斷標準，且模型組大鼠體溫、24小時尿17-OH-CS含量均顯著下降，說明腎陽虛證動物模型建立成功。
　　 ②模型組大鼠血清GAS、D-木糖含量較假手術組顯著下降，說明腎陽虛證模型動物的消化吸收功能下降。
　　 ③模型組大鼠胃竇粘膜組織的凋亡率、G細胞表達Caspase-3的百分率顯著升高，G細胞表達的平均光密度值顯著降低，說明胃竇粘膜組織及其G細胞的過度凋亡

10、影響了GAS的分泌，進而影響了模型大鼠的消化功能。
　　 ④模型組大鼠小腸粘膜吸收細胞的超微組織結構改變符合凋亡細胞的典型表現(xiàn)，吸收細胞的凋亡率明顯升高，同時，小腸吸收細胞Bax蛋白的表達顯著升高，凋亡明顯，凋亡與增殖失衡，使小腸粘膜吸收細胞凋亡增加，增殖不足，得不到及時更新，從而影響了模型大鼠的吸收功能。
　　 ⑤溫補腎陽方藥—參附湯可以調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達，從而抑制消化吸收相關

11、組織細胞的過度凋亡，促進其更新，維護其功能，從而改善腎陽虛證模型大鼠的消化吸收功能。
　　 本課題首次采用雙側腎上腺大部切除的方法建立腎陽虛證動物模型，率先運用現(xiàn)代技術方法研究腎陽虛影響消化吸收功能的相關機制。腎陽虛證模型大鼠胃竇粘膜組織G細胞凋亡關鍵蛋白Caspase-3的表達顯著增強，小腸粘膜吸收細胞的促凋亡基因Bax表達顯著增強，使模型大鼠消化吸收相關組織細胞凋亡增加，功能受損，進而表現(xiàn)為消化吸收功能下降。溫補腎陽方藥—參