基于“主客交”理論的透邪通絡(luò)法對肝纖維化大鼠肝臟基質(zhì)中TGF-β-Smads通路影響的研究.pdf

1、目的：
　　觀察透邪通絡(luò)法代表方加減三甲散對免疫性肝纖維化大鼠肝臟基質(zhì)中TGF-β/Smads信號(hào)通路的影響，探討加減三甲散改善肝纖維化的效果是否與抑制肝臟肝星狀細(xì)胞的活化相關(guān)，以期部分揭示“主客交”理論的科學(xué)內(nèi)涵。
　　方法：
　　選用SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只，設(shè)置正常組20只、模型對照組20只、陽性對照組10只和透邪通絡(luò)組10只。除正常組外，其余3組均采用豬血清腹腔注射復(fù)制免疫性肝纖維化模型。豬血清注射1

2、2周后，隨機(jī)處死正常組和模型對照組大鼠（此時(shí)記錄為模型1組）各6只，取肝臟組織，HE和MASSON染色后光鏡觀察肝臟病理形態(tài)，判斷造模是否成功，并取其肝臟組織及血清標(biāo)本。確定造模成功后，透邪通絡(luò)組給予加減三甲散方藥物灌胃，陽性對照組給予復(fù)方鱉甲軟肝片灌胃，正常組及模型對照組（此時(shí)記錄為模型2組）給予同體積的生理鹽水灌胃，治療60天結(jié)束，隨機(jī)處死各組大鼠各6只，取肝臟組織，HE和MASSON染色光鏡觀察肝臟病理形態(tài)，Wester-Blot

3、法檢測肝組織α-SMA、TGF-β1蛋白含量，RT-PCR法檢測肝臟組織Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β1、TGFβII型受體、I、III型膠原、CTGFmRNA含量。心臟采血，ELISA法檢測肝纖維化指標(biāo)，CTGF蛋白含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，LSD兩兩比較，當(dāng)p＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.肝臟病理學(xué)觀察
　　造模12周時(shí)，模型1組肝組織病理切片光鏡下

4、已見纖維條索由匯管區(qū)及中央靜脈分離出，包繞肝小葉，有形成假小葉之勢或者已經(jīng)形成假小葉。60天后，模型2組肝組織病理切片光鏡下已見中央靜脈及匯管區(qū)明顯纖維組織增生，較模型1組已有明顯纖維橋連接及假小葉形成。
　　2.血清肝纖維化指標(biāo)
　　模型2組HA、LN、CⅣ、PCⅢ水平較其余四組均有不同程度的升高(P＜0.01 或P＜0.05)，透邪通絡(luò)組PCⅢ、LA水平均較正常組升高(P＜0.01或P＜0.05)，PCⅢ、HA

5、及LN水平較模型2組均下降(P＜0.01或P＜0.05)，陽性對照組PCⅢ、LA水平均較正常組升高(P＜0.01或P＜0.05)，HA、LN、PCⅢ水平較模型2組均下降(P＜0.01或P＜0.05)，與透邪通絡(luò)組比較，無差異(P＞0.05)。
　　3.肝組織α-SMA、TGF-β1蛋白含量
　　與正常組相比，模型2組α-SMA表達(dá)升高（p<0.05），透邪通絡(luò)組α-SMA表達(dá)顯著下降（p<0.01）；與模型1組相比，模型2組

6、α-SMA表達(dá)顯著升高（p<0.01）；與模型2組相比，正常組、模型1組、透邪通絡(luò)組、陽性對照組α-SMA表達(dá)均顯著下降（P<0.01或P<0.05）；而各組TGF-β1表達(dá)均無顯著變化。
　　4.肝組織I、III型膠原mRNA含量
　　模型1組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)較正常組升高（p<0.05）；正常組、透邪通絡(luò)組、陽性對照組的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)較模型1組均顯著降低（P<0.01或P<0.05）；透邪通絡(luò)組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)較模型2組

7、降低（p<0.05）；模型1組的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)較陽性對照組均顯著降低（P<0.01或P<0.05），模型2組的Ⅲ型膠原表達(dá)較陽性對照組降低（p<0.05），陽性對照組與透邪通絡(luò)組表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。
　　5.TGFβ/Smads通路中大鼠肝臟組織Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β1、TGFβII型受體、CTGFmRNA含量比較
　　與正常組相比，模型2組smad2、smad7、TGF-β1、TGFβ

8、RⅡmRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01或P<0.05），陽性對照組smad7、TGFβRⅡmRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01或P<0.05）。
　　與模型1組相比，模型2組smad2、smad7、TGFβRⅡ表達(dá)明顯升高（P<0.01或P<0.05），陽性對照組smad7、TGFβRⅡ表達(dá)升高（P<0.05）。
　　與模型2組相比，正常組smad2、smad7、TGF-β1、TGFβRⅡ表達(dá)顯著下降（P<0.01或P<0.0

9、5），模型1組smad2、smad7、TGFβRⅡ表達(dá)顯著下降（P<0.01或P<0.05），透邪通絡(luò)組smad2、smad7、CTGF、TGF-β1表達(dá)顯著下降（P<0.01或P<0.05），陽性對照組TGF-β1表達(dá)下降（P<0.05）。
　　與陽性對照組相比，正常組smad7、TGFβRⅡ表達(dá)顯著下降（P<0.01或P<0.05），模型1組smad7、TGFβRⅡ表達(dá)下降（P<0.05）；模型2組TGF-β1表達(dá)升高（P<0

10、.05），透邪通絡(luò)組smad7表達(dá)顯著下降（P<0.01或P<0.05）。其中，陽性對照組和透邪通絡(luò)組表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。
　　6肝組織CTGF蛋白含量比較
　　與正常組相比，陽性對照組蛋白表達(dá)降低（P<0.05）；與模型2組相比，透邪通絡(luò)組蛋白表達(dá)降低（P<0.05）、陽性對照組顯著降低（P<0.01或P<0.05）；與透邪通絡(luò)組相比，模型2組蛋白表達(dá)升高（P<0.05）；與陽性對照組相比，正常組蛋白表達(dá)升高（

11、P<0.05）、模型2組蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01或P<0.05）。陽性對照組與透邪通絡(luò)組表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)病理形態(tài)觀察，采用豬血清腹腔注射12周能成功復(fù)制大鼠肝纖維化模型。
　　2.加減三甲散可以明顯下調(diào)HSC中的α-SMA、TGF-β1、smad2、CTGF、Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)HA、LN及PCⅢ的產(chǎn)生和沉積，因此推斷：加減三甲散是通過阻斷TGF-β/