生物型異種骨生物相容性細(xì)胞學(xué)及免疫學(xué)研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)分細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)兩部分，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)采用材料在體外與細(xì)胞共培養(yǎng)，通過Transwell試驗(yàn)測(cè)定成骨細(xì)胞的遷移能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況，ANPP法檢測(cè)AFP，MTT法評(píng)價(jià)異種骨的細(xì)胞毒性，溶血試驗(yàn)觀察材料與血液的相容性情況。結(jié)合上述方法來綜合評(píng)價(jià)異種骨與成骨細(xì)胞的體外的成骨能力和生物相容性。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)通過建立羊頸椎異種骨融合器植入動(dòng)物模型，觀察異種骨植入后分時(shí)段抽取動(dòng)物模型血液，通過流式細(xì)胞儀

2、來檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CD4+及CD8+淋巴細(xì)胞，CD4+/IL-2+T細(xì)胞及CD4+/IL-4+T細(xì)胞的含量來評(píng)定免疫排斥反應(yīng)情況，進(jìn)一步為生物型異種骨移植材料應(yīng)用于臨床提供安全性和有效性的依據(jù)。
　　方法:生物型異種松質(zhì)骨:由廣東冠昊生物科技股份有限公司采用已獲得美國專利授權(quán)(US6106555A，US6231614B1)的技術(shù)制備;生物型異種骨頸椎融合器:由廣東冠昊生物科技股份有限公司制備;SD大鼠成骨細(xì)胞株由廣州軍區(qū)總醫(yī)院骨科實(shí)

3、驗(yàn)室液氮凍存;成年本地山羊18只，體重25～30kg，由廣東冠昊生物科技有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
　　第一章 異種骨生物相容性細(xì)胞學(xué)研究
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)分成3組，分別是實(shí)驗(yàn)組（交聯(lián)的異種骨組），陽性對(duì)照組（未交聯(lián)的異種骨組）和陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組將交聯(lián)的異種骨與SD大鼠成骨細(xì)胞在H-DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng);陽性對(duì)照組將未交聯(lián)的異種骨與SD大鼠成骨細(xì)胞在H-DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng);陰性對(duì)照組將SD大鼠成骨細(xì)

4、胞直接在普通H-DMEM培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后1、3、5、7天用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)法測(cè)定吸光度值，以評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖情況，反應(yīng)異種骨的細(xì)胞毒性及生物相容性。采用PNPP偶氮法分別測(cè)定3天，1周，2周，3周時(shí)的ALP量，以評(píng)價(jià)異種骨對(duì)成骨細(xì)胞成骨的影響。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化以及成骨細(xì)胞凋亡情況，以評(píng)價(jià)異種骨對(duì)成骨細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　結(jié)果:

5、>　　1、成骨細(xì)胞增殖活性培養(yǎng)1、3、5、7d后在顯微鏡下觀察可見實(shí)驗(yàn)組，陽性對(duì)照組及陰性對(duì)照組成骨細(xì)胞形態(tài)均良好。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，OD值均升高，在1d、3d、5d、7d時(shí)間點(diǎn)，三組間比較采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示同一時(shí)間點(diǎn)三個(gè)組間吸光度值兩兩比較差別均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，MTT法測(cè)定OD值可間接反應(yīng)細(xì)胞增殖數(shù)量，表明異種骨材料對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性無不良影響，與成骨細(xì)胞相容性良好，

6、無明顯細(xì)胞毒性。
　　2、PNPP偶氮法測(cè)定出ALP的OD值加入成骨誘導(dǎo)液后3天后在顯微鏡下觀察三個(gè)組的成骨細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示三個(gè)組H-DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞形態(tài)均良好，采用PNPP法測(cè)定OD值可間接反應(yīng)細(xì)胞成骨能力，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，三個(gè)組OD值均升高，表明三組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。三組間比較采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示3天及7天時(shí)3組間兩兩比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);2周及3周

7、時(shí)，實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組跟陰性對(duì)照組比較差別均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組跟陽性對(duì)照組比較差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、生物型異種骨體外培養(yǎng)狀態(tài)下可以促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的成骨能力和遷徙能力，交聯(lián)后的異種骨比未經(jīng)交聯(lián)處理的異種骨這種促進(jìn)作用更加明顯。
　　2、生物型異種骨體外培養(yǎng)狀態(tài)下24小時(shí)內(nèi)對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的凋亡無明顯影響，48小時(shí)時(shí)，未交聯(lián)的異種骨可以明顯增加成骨細(xì)胞的凋亡率，而

8、交聯(lián)后的異種骨無此影響。
　　3、生物型異種骨體外培養(yǎng)狀態(tài)下對(duì)大鼠成骨細(xì)胞成骨的增殖活性和細(xì)胞周期無不良影響，不會(huì)引起明顯溶血反應(yīng)，具有良好的生物相容性。
　　第二章 異種骨生物相容性免疫學(xué)研究
　　方法:
　　18只成年本地山羊，體重25～30kg，隨機(jī)分成3組，每組6只。A組為自體髂骨組，手術(shù)植入自體髂骨，鋼板固定;B組為異種骨融合器組，手術(shù)植入異種骨融合器加自體骨，鋼板固定;C組為陰性對(duì)照組，不給予手術(shù)處理

9、，用于對(duì)照。分別于1w、2w、4w、8w抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液20ml，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分別測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組血標(biāo)本中CD4+/IL-2+，CD4+/IL-4+; CD4+，CD8+T淋巴細(xì)胞的含量，用于評(píng)價(jià)山羊?qū)Ξ惙N骨免的疫排斥反應(yīng)情況。
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)+s)表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1、一般情況1只

10、山羊術(shù)后當(dāng)天因麻醉相關(guān)并發(fā)癥死亡，當(dāng)天補(bǔ)上1只替代。所有山羊術(shù)后正常進(jìn)食及野外放養(yǎng)，每天觀察傷口情況，術(shù)后部分山羊切口輕度腫脹，5天后腫脹基本消失。術(shù)后所有傷口愈合良好。
　　2、標(biāo)本大體觀察術(shù)后12周時(shí)A組頸3/4椎體間大部分融合，融合節(jié)段可見大量骨痂形成;B組融合器與上下椎體融合較差，結(jié)合處可見少量骨痂。術(shù)后24周時(shí)A組兩椎體完全融合，B組融合效果欠佳。
　　3、CD4+及CD8+T細(xì)胞測(cè)定結(jié)果1周時(shí)，三個(gè)組間兩兩比較均

11、無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;2周時(shí)，自體骨組與陰性對(duì)照組之間CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)值比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);自體骨組與異種骨融合器組之間CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞值相比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);異種骨融合組與陰性對(duì)照組之間CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞值比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);4周時(shí)，自體骨組與陰性對(duì)照組之間CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞值比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;自

12、體骨組與異種骨融合器組之間CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞值相比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);異種骨融合組與陰性對(duì)照組之間CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞值比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);8周時(shí)，自體骨組與陰性對(duì)照組之間CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)值比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);自體骨組與異種骨融合器組之間CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞值相比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);異種骨融合組與陰性對(duì)照組之間CD4+及C

13、D8+T淋巴細(xì)胞值比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4、CD4+/IL-2+T細(xì)胞及CD4+/IL-4+T細(xì)胞測(cè)定結(jié)果1周時(shí)，自體骨組與陰性對(duì)照組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），異種骨融合器組與陰性對(duì)照組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），異種骨融合組與自體骨組之間CD

14、4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;2周時(shí)，自體骨組與陰性對(duì)照組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，異種骨融合器組與陰性對(duì)照組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），異種骨融合器組與自體骨組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD

15、4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較，均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);4周時(shí)，自體骨組與陰性對(duì)照組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;異種骨融合器組與陰性對(duì)照組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);異種骨融合組與自體骨組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比

16、較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);8周時(shí)，自體骨組與陰性對(duì)照組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），異種骨融合器組與陰性對(duì)照組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，異種骨融合組與自體骨組之間CD4+/IL-2+T淋巴細(xì)胞及CD4+/IL-4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目比較均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05

17、)。
　　結(jié)論:
　　1、異種骨椎間融合器植入羊體內(nèi)后早期會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)導(dǎo)致CD4+及CD8+T細(xì)胞及CD4+/IL-2+T及CD4+/IL-4+T細(xì)胞升高，4W左右最顯著，隨后逐漸下降，8周時(shí)CD4+及CD8+T細(xì)胞及CD4+/IL-2+T及CD4+/IL-4+T細(xì)胞數(shù)量逐漸接近正常。
　　2、手術(shù)創(chuàng)傷，疼痛可以引起山羊體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致體內(nèi)CD4+/IL-2+T細(xì)胞及CD4+/IL-4+T細(xì)胞數(shù)目升高，這種效應(yīng)