胰島素敏感性評價方法的建立及其在藥物研究中的應(yīng)用.pdf

1、【目的】
　　 真實(shí)準(zhǔn)確地評估胰島素敏感性，對于糖代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的研究以及胰島素增敏藥物的研發(fā)具有重要意義。本課題擬在大鼠和小鼠上建立整體水平評價胰島素敏感性的主要方法，特別是難度較大的評價胰島素敏感性的金標(biāo)準(zhǔn)“高胰島素-正葡萄糖鉗夾法”，并形成一系列標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用已建立的各種方法系統(tǒng)考察磷酸腺苷激活的蛋白激酶α2催化亞單位（Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kin

2、ase Catalytic Subunit α2, AMPKα2)基因敲除小鼠的胰島素敏感性。最后，評價新靶點(diǎn)藥物尼古丁乙酰膽堿α7受體, (α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7 nAChR) 特異性激動劑PNU-282987長期治療對胰島素敏感性的改善作用。
　　 【方法】
　　 第一部分：胰島素敏感性評價方法的建立。首先，分別考察麻醉劑量、導(dǎo)管留置位置、插管的長度、深度等條件

3、以確定麻醉大鼠和小鼠高胰島素-正葡萄糖鉗夾法的最佳實(shí)驗(yàn)方案。然后，又通過比較插管術(shù)后導(dǎo)管的固定方法和術(shù)后恢復(fù)不同時間對鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響以確定清醒大鼠高胰島素-正葡萄糖鉗夾法的最佳實(shí)驗(yàn)方案。最后，完善本課題組前期建立的胰島素耐量實(shí)驗(yàn)、糖耐量實(shí)驗(yàn)、血糖和胰島素測定等實(shí)驗(yàn)方法，并撰寫相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。
　　 第二部分：胰島素敏感性評價方法在藥物研究中的應(yīng)用。首先，用已建立的胰島素耐量實(shí)驗(yàn)、葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)、HOMA-IR、高胰島素-正

4、葡萄糖鉗夾等方法對AMPKα2基因敲除小鼠和野生型小鼠的胰島素敏感性進(jìn)行全面評價。接著，考察α7 nAChR受體特異激動劑PNU-282987長期治療對胰島素抵抗的改善作用。將AMPKα2基因敲除小鼠分為兩組，分別腹腔注射生理鹽水和PNU-282987 (0.53mg/kg)，每天一次，連續(xù)治療6周，通過檢測上述指標(biāo)考察胰島素敏感性變化。
　　 【結(jié)果】
　　 第一部分：胰島素敏感性評價方法的建立。
　　 1.確

5、定了麻醉大鼠、小鼠和清醒大鼠高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)的最佳方案。實(shí)驗(yàn)顯示麻醉Sprague Dawley（SD）大鼠的平均葡萄糖輸入速度（GIR）為26.9±2.5mg/(kg·min)，清醒SD大鼠的為29.4±0.8mg/(kg·min)，麻醉C57BL/6J (C57)小鼠的為82.6±9.2mg/(kg·min)。2. 完成麻醉大鼠、小鼠和清醒大鼠高胰島素-正葡萄糖鉗夾標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的撰寫；完成大鼠和小鼠的胰島素耐量實(shí)驗(yàn)、葡萄糖

6、耐量實(shí)驗(yàn)等其它相關(guān)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的撰寫。
　　 第二部分：胰島素敏感性評價方法在藥物研究中的應(yīng)用。
　　 1.AMPKα2基因敲除小鼠與野生型的HOMA-IR值無明顯差異。胰島素耐量實(shí)驗(yàn)顯示，在給予胰島素后30分鐘和45分鐘時，AMPKα2基因敲除小鼠的血糖下降幅度顯著小于野生型。口服糖耐量實(shí)驗(yàn)顯示，在給予葡萄糖后60分鐘和90分鐘時，AMPKα2基因敲除小鼠的血糖顯著高于野生型。同時，在糖負(fù)荷后30分鐘和60分鐘時間

7、點(diǎn)上，AMPKα2基因敲除小鼠的胰島素濃度顯著低于野生型。高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)顯示，AMPKα2基因敲除小鼠GIR為55.8±5.4mg/(kg·min)，野生型的GIR=82.6±9.2 mg/(kg·min), 它們之間的差異顯著。
　　 2.經(jīng)過6周治療后，PNU-282987顯著改善AMPKα2基因敲除小鼠的HOMA-IR指數(shù)。胰島素糖耐量實(shí)驗(yàn)顯示，與生理鹽水治療組相比，PNU-282987治療組在15，30，45

8、分鐘血糖降低幅度更大。葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)顯示，在糖負(fù)荷后的0，30，60，90分鐘時，PNU-282987治療組血糖顯著低于生理鹽水治療組，而兩組胰島素水平始終無顯著差異。
　　 【結(jié)論】
　　 1.本課題在麻醉大鼠、小鼠和清醒大鼠上成功建立了評價胰島素敏感性金標(biāo)準(zhǔn)方法“高胰島素-正葡萄糖鉗夾法”。
　　 2.本室引進(jìn)的AMPKα2基因敲除小鼠具有顯著胰島素抵抗，葡萄糖耐量降低，同時葡萄糖刺激的胰島素分泌能力減弱的特