匙吻鱘雌核發(fā)育誘導及其相關機制研究.pdf

1、匙吻鱘(Polyodon spathula)隸屬鱘形目(Acipenseriformes)、白鱘科(Polyodontidae)、匙吻鱘屬(Polyodon),是美國特有的大型淡水經濟魚類,也是世界上現有的白鱘科魚類之一,與我國白鱘是同科異屬的珍稀動物。匙吻鱘具有生長快、品質優(yōu)、適應性廣、抗逆能力強等特點,且肉質細膩、營養(yǎng)豐富,是公認的優(yōu)良養(yǎng)殖魚類。我國于20世紀90年代初從美國引進匙吻鱘受精卵進行人工孵化并試養(yǎng)成功,目前匙吻鱘已成為我

2、國水產養(yǎng)殖業(yè)廣受歡迎的一個名優(yōu)新品種。
　　 由于匙吻鱘與白鱘(Psephurus gladius)同屬于白鱘科,因此開展匙吻鱘雌核發(fā)育的人工誘導實驗可為長江白鱘的種群恢復奠定技術基礎。此外,近幾年隨著匙吻鱘養(yǎng)殖產業(yè)的形成,國內每年可人工繁殖的匙吻鱘苗種達數百萬尾,獲得抗病強,生長快等優(yōu)良性狀的匙吻鱘品系是育種工作的首要任務。
　　 人工誘導雌核發(fā)育技術是快速建立其純系,選育優(yōu)良品種的有效途徑,為此本研究以我國人工養(yǎng)殖的

3、匙吻鱘為研究對象,采用施氏鱘(Acipenser schrenckii)精子誘導匙吻鱘雌核發(fā)育二倍體,通過形態(tài)學、細胞遺傳學方法與微衛(wèi)星分子標記對雌核發(fā)育群體進行了鑒定,同時,采用掃描電鏡、透射電鏡和慧星實驗對紫外線照射的精子的超微結構和核DNA損傷程度進行了研究,最后,對雌核發(fā)育匙吻鱘受精細胞學及其性別決定機制進行初步的探討,主要研究結果如下:
　　 1.在以匙吻鱘為母本,施氏鱘為父本的雜交試驗中發(fā)現,雜交胚胎能發(fā)育到原腸期,

4、但無孵出存活,胚胎在出膜前因發(fā)育畸形而死亡,經胚胎染色體計數分析表明其染色體為n=60,從而確定,施氏鱘精子與匙吻鱘卵子雜交所得后代即為匙吻鱘的單倍體?；谶@個研究結果,本研究首次采用施氏鱘鮮精作為誘導匙吻鱘雌核發(fā)育的激活源,通過對雌核發(fā)育熱休克起始時間,熱休克溫度和熱休克持續(xù)時間的篩選和優(yōu)化,確定了利用施氏鱘鮮精誘導匙吻鱘卵雌核發(fā)育的最佳條件是:在18℃水溫中授精18 min后,用37℃的淡水對卵進行熱休克處理2 min。該組受精率為

5、76.4±9.2％,胚胎孵化率為7.8±1.4％。本研究同時篩選出了施氏鱘精子遺傳失活的條件,即采用波長為254 nm的紫外線照射(照射強度為863μw/cm2)5 min能使施氏鱘精子遺傳失活。采用遺傳失活的施氏鱘精子與匙吻鱘卵授精后熱休克的方法誘導匙吻鱘雌核發(fā)育,該組受精率為56.4±1.2％,胚胎孵化率為28.7±1.8％。
　　 在雌核發(fā)育后代鑒定的實驗中,分別采用了形態(tài)學、染色體計數和核型分析、流式細胞儀檢測DNA含量

6、和微衛(wèi)星標記技術對雌核發(fā)育魚苗進行了鑒定。結果發(fā)現,對照組匙吻鱘和雌核發(fā)育匙吻鱘在形態(tài)上沒有差異,對照組和雌核發(fā)育組匙吻鱘的染色體組均由80條基本染色體和40條微型染色體組成。根據Levan,et al的分類標準,對匙吻鱘10個中期分裂相進行放大測定,按染色體臂比及相對長度把匙吻鱘染色體分為3組:中部著絲點粒染色體(m)44條、亞中部著絲粒染色體(sm)32條、亞端部著絲粒染色體(st)和端部著絲粒染色體(t).44條。染色體臂數(NF

7、)為196,其核型公式為44m+32sm+44st,t。對對照組二倍體血液樣品和雌核發(fā)育匙吻鱘血液樣品進行DNA相對含量的檢測,雌核發(fā)育匙吻鱘紅細胞的DNA含量與二倍體匙吻鱘紅細胞DNA含量比為1:1,其相對含量在3.50-3.59 pg。
　　 2.采用掃描電鏡和透射電鏡觀察了經紫外線輻射前后施氏鱘精子形態(tài)結構和超微結構的變化。結果表明,成熟的施氏鱘精子由頂體、細胞核、中段和尾部三部分構成,其平均長度(頂體+細胞核+中段)為8

8、.95μm,加上尾長(36.80μm)共約45.75μm。鮮精具有明顯的頂體及后外側延伸物,頂體中含有亞頂體、頂體泡和項體腔,項體腔中有少量顆粒狀物質。經紫外線照射后,精子表現出頂體不明顯或項體與核發(fā)生糅合,后外側延伸物消失或變短,頂體膜受損,頂體腔增大,顆粒物質丟失,有的精子甚至頂體脫落；頂體泡、亞項體與核之間的排列松弛,線粒體內嵴彌散或線粒體脫落。可以推斷,紫外線照射對精子膜、項體、線粒體和鞭毛的損傷可能是造成精子活力和受精率降低的

9、原因。
　　 為了更好地了解紫外線輻射與精核DNA相互作用的機理,本文首次采用慧星實驗探明了紫外線照射對精子DNA完整性的影響。實驗結果表明:隨著。UV照射劑量的增加,施氏鱘精核DNA斷片增多,慧星狀細胞數和慧尾長度也增加。紫外線照射時間大于5 min時,精子的彗星率、損傷系數與鮮精差異顯著(P<0.05)。紫外線照射劑量與出現彗尾的頻率及長度呈明顯劑量-效應關系。
　　 3.運用組織學方法研究了人工誘導匙吻鱘卵子雌核發(fā)

10、育的細胞學過程。在光鏡下對第二極體抑制型雌核發(fā)育匙吻鱘二倍體卵在受精過程中的核相變化進行了詳細觀察。結果表明,精子入卵后精核始終不解凝,也不與雌性原核融合,是典型的雌核發(fā)育魚類的受精細胞學特征。
　　 同時,對培育1年后的3個雌核發(fā)育群體和2個對照組群體經解剖取性腺,Bouin氏液固定,常規(guī)組織切片,性別鑒定結果顯示2個對照組家系子代的性別比例都接近于理論值1:1,沒有顯著性差異(P>0.05)；而3個雌核發(fā)育群體中,雌性所占百