匙吻鱘雌核發(fā)育誘導(dǎo)及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、匙吻鱘(Polyodon spathula)隸屬鱘形目(Acipenseriformes)、白鱘科(Polyodontidae)、匙吻鱘屬(Polyodon),是美國特有的大型淡水經(jīng)濟(jì)魚類,也是世界上現(xiàn)有的白鱘科魚類之一,與我國白鱘是同科異屬的珍稀動(dòng)物。匙吻鱘具有生長快、品質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)性廣、抗逆能力強(qiáng)等特點(diǎn),且肉質(zhì)細(xì)膩、營養(yǎng)豐富,是公認(rèn)的優(yōu)良養(yǎng)殖魚類。我國于20世紀(jì)90年代初從美國引進(jìn)匙吻鱘受精卵進(jìn)行人工孵化并試養(yǎng)成功,目前匙吻鱘已成為我

2、國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)廣受歡迎的一個(gè)名優(yōu)新品種。
　　 由于匙吻鱘與白鱘(Psephurus gladius)同屬于白鱘科,因此開展匙吻鱘雌核發(fā)育的人工誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)可為長江白鱘的種群恢復(fù)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。此外,近幾年隨著匙吻鱘養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的形成,國內(nèi)每年可人工繁殖的匙吻鱘苗種達(dá)數(shù)百萬尾,獲得抗病強(qiáng),生長快等優(yōu)良性狀的匙吻鱘品系是育種工作的首要任務(wù)。
　　 人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)是快速建立其純系,選育優(yōu)良品種的有效途徑,為此本研究以我國人工養(yǎng)殖的

3、匙吻鱘為研究對(duì)象,采用施氏鱘(Acipenser schrenckii)精子誘導(dǎo)匙吻鱘雌核發(fā)育二倍體,通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)方法與微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)雌核發(fā)育群體進(jìn)行了鑒定,同時(shí),采用掃描電鏡、透射電鏡和慧星實(shí)驗(yàn)對(duì)紫外線照射的精子的超微結(jié)構(gòu)和核DNA損傷程度進(jìn)行了研究,最后,對(duì)雌核發(fā)育匙吻鱘受精細(xì)胞學(xué)及其性別決定機(jī)制進(jìn)行初步的探討,主要研究結(jié)果如下:
　　 1.在以匙吻鱘為母本,施氏鱘為父本的雜交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),雜交胚胎能發(fā)育到原腸期,

4、但無孵出存活,胚胎在出膜前因發(fā)育畸形而死亡,經(jīng)胚胎染色體計(jì)數(shù)分析表明其染色體為n=60,從而確定,施氏鱘精子與匙吻鱘卵子雜交所得后代即為匙吻鱘的單倍體?；谶@個(gè)研究結(jié)果,本研究首次采用施氏鱘鮮精作為誘導(dǎo)匙吻鱘雌核發(fā)育的激活源,通過對(duì)雌核發(fā)育熱休克起始時(shí)間,熱休克溫度和熱休克持續(xù)時(shí)間的篩選和優(yōu)化,確定了利用施氏鱘鮮精誘導(dǎo)匙吻鱘卵雌核發(fā)育的最佳條件是:在18℃水溫中授精18 min后,用37℃的淡水對(duì)卵進(jìn)行熱休克處理2 min。該組受精率為

5、76.4±9.2％,胚胎孵化率為7.8±1.4％。本研究同時(shí)篩選出了施氏鱘精子遺傳失活的條件,即采用波長為254 nm的紫外線照射(照射強(qiáng)度為863μw/cm2)5 min能使施氏鱘精子遺傳失活。采用遺傳失活的施氏鱘精子與匙吻鱘卵授精后熱休克的方法誘導(dǎo)匙吻鱘雌核發(fā)育,該組受精率為56.4±1.2％,胚胎孵化率為28.7±1.8％。
　　 在雌核發(fā)育后代鑒定的實(shí)驗(yàn)中,分別采用了形態(tài)學(xué)、染色體計(jì)數(shù)和核型分析、流式細(xì)胞儀檢測DNA含量

6、和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)雌核發(fā)育魚苗進(jìn)行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組匙吻鱘和雌核發(fā)育匙吻鱘在形態(tài)上沒有差異,對(duì)照組和雌核發(fā)育組匙吻鱘的染色體組均由80條基本染色體和40條微型染色體組成。根據(jù)Levan,et al的分類標(biāo)準(zhǔn),對(duì)匙吻鱘10個(gè)中期分裂相進(jìn)行放大測定,按染色體臂比及相對(duì)長度把匙吻鱘染色體分為3組:中部著絲點(diǎn)粒染色體(m)44條、亞中部著絲粒染色體(sm)32條、亞端部著絲粒染色體(st)和端部著絲粒染色體(t).44條。染色體臂數(shù)(NF

7、)為196,其核型公式為44m+32sm+44st,t。對(duì)對(duì)照組二倍體血液樣品和雌核發(fā)育匙吻鱘血液樣品進(jìn)行DNA相對(duì)含量的檢測,雌核發(fā)育匙吻鱘紅細(xì)胞的DNA含量與二倍體匙吻鱘紅細(xì)胞DNA含量比為1:1,其相對(duì)含量在3.50-3.59 pg。
　　 2.采用掃描電鏡和透射電鏡觀察了經(jīng)紫外線輻射前后施氏鱘精子形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明,成熟的施氏鱘精子由頂體、細(xì)胞核、中段和尾部三部分構(gòu)成,其平均長度(頂體+細(xì)胞核+中段)為8

8、.95μm,加上尾長(36.80μm)共約45.75μm。鮮精具有明顯的頂體及后外側(cè)延伸物,頂體中含有亞頂體、頂體泡和項(xiàng)體腔,項(xiàng)體腔中有少量顆粒狀物質(zhì)。經(jīng)紫外線照射后,精子表現(xiàn)出頂體不明顯或項(xiàng)體與核發(fā)生糅合,后外側(cè)延伸物消失或變短,頂體膜受損,頂體腔增大,顆粒物質(zhì)丟失,有的精子甚至頂體脫落；頂體泡、亞項(xiàng)體與核之間的排列松弛,線粒體內(nèi)嵴彌散或線粒體脫落。可以推斷,紫外線照射對(duì)精子膜、項(xiàng)體、線粒體和鞭毛的損傷可能是造成精子活力和受精率降低的

9、原因。
　　 為了更好地了解紫外線輻射與精核DNA相互作用的機(jī)理,本文首次采用慧星實(shí)驗(yàn)探明了紫外線照射對(duì)精子DNA完整性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:隨著。UV照射劑量的增加,施氏鱘精核DNA斷片增多,慧星狀細(xì)胞數(shù)和慧尾長度也增加。紫外線照射時(shí)間大于5 min時(shí),精子的彗星率、損傷系數(shù)與鮮精差異顯著(P<0.05)。紫外線照射劑量與出現(xiàn)彗尾的頻率及長度呈明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 3.運(yùn)用組織學(xué)方法研究了人工誘導(dǎo)匙吻鱘卵子雌核發(fā)

10、育的細(xì)胞學(xué)過程。在光鏡下對(duì)第二極體抑制型雌核發(fā)育匙吻鱘二倍體卵在受精過程中的核相變化進(jìn)行了詳細(xì)觀察。結(jié)果表明,精子入卵后精核始終不解凝,也不與雌性原核融合,是典型的雌核發(fā)育魚類的受精細(xì)胞學(xué)特征。
　　 同時(shí),對(duì)培育1年后的3個(gè)雌核發(fā)育群體和2個(gè)對(duì)照組群體經(jīng)解剖取性腺,Bouin氏液固定,常規(guī)組織切片,性別鑒定結(jié)果顯示2個(gè)對(duì)照組家系子代的性別比例都接近于理論值1:1,沒有顯著性差異(P>0.05)；而3個(gè)雌核發(fā)育群體中,雌性所占百