金魚雌核發(fā)育及其性別分化相關基因的表達.pdf

1、人工雌核發(fā)育是一種高效的性別控制育種方式,結合性反轉技術可以使獲得的后代為全雌魚苗。本研究利用金魚(Carassius auratus)進行了人工雌核發(fā)育的初探,旨在掌握金魚雌核發(fā)育過程中的關鍵技術,之后用甲基睪酮浸浴使其性逆轉。同時分析Cyp19a、Dmrt2a、Dmrt2b基因在金魚中的表達情況,并克隆獲得Cyp19a基因全長和Dmrt2a的cDNA全長,為從分子水平上調控金魚性別分化提供理論基礎。
　　論文包括以下三部分內容

2、:
　　1.本文以 Hank's液稀釋健康五花金魚精液,紫外線照射方式進行精子滅活處理,紫外線強度為30mJ/cm2,照射時間為3 min。取健康紅珍珠金魚300余粒卵子人工受精。之后采用冷應激的方法對染色體加倍處理,處理條件為0℃冷應激45 min。試驗過程中設置了一個單倍體對照組,即精子經過相同強度和時間的紫外處理,但之后不經過冷應激。
　　孵化過程中觀察雌核發(fā)育二倍體金魚胚胎和仔魚的發(fā)育,與正常金魚無異,而單倍體對照組

3、個體出現了單倍體綜合癥。將雌核發(fā)育二倍體胚胎進行細胞培養(yǎng),然后分析核型,確定其染色體數目為2n=100。最后孵出仔魚49條,根據驗證結果,初步確定試驗中所使用的紫外照射和冷應激條件是合適的。
　　2.通過3' RACE PCR方法擴增獲得 Cyp19a基因的3’非編碼區(qū)序列,獲得 cDNA全長1,557 bp。之后通過梯度 PCR得到 Cyp19a基因內含子序列;采用基因組步移法的獲得5'端調控區(qū)序列,拼接得到 Cyp19a基因

4、DNA全長共6,905 bp,包括9個外顯子和8個內含子(GenBank登錄號 No. FJ601913.1)。
　　在金魚 Cyp19a基因2000bp的5'端序列內,位于該序列-48bp處存在一個TATA框,位于-76bp處存在一個 CAAT框,在線軟件預測金魚 Cyp19a基因5'端區(qū)域存在一些保守的調控因子,如甾類生成因子1基因(SF1)識別位點,雌激素受體(ER),SOX-5,SOX-17,叉頭框(FORKHEAD)等轉

5、錄因子結合位點。
　　為了驗證金魚 Cyp19a基因5'端調控區(qū)啟動子活性,將Cyp19a基因5'端調控區(qū)插入到啟動子缺失的增強型綠色熒光蛋白表達載體 pEGFP-1中,之后將重組的載體轉染到293T細胞中進行瞬時表達,在熒光倒置顯微鏡下可以檢測到綠色熒光信號,表明克隆得到的金魚 Cyp19a基因5'端調控區(qū)具有啟動子活性。
　　熒光定量分析顯示,Cyp19a主要在卵巢中表達,在腦中的表達量較低,卵巢中的表達量是腦中的5倍,

6、而在其他的組織中表達量更低。比較不同發(fā)育時期的相對表達量,Cyp19a在仔魚孵化后的表達量一直很低,在孵化后26天得時候表達量顯著升高,而在經過甲基睪酮浸浴處理的26天齡的仔魚體內 Cyp19a沒有顯著升高。
　　免疫組化結果顯示,Cyp19a存在于成魚卵巢結締組織的間質細胞中,以及孵化后48天齡的仔魚卵巢中。成魚的精巢和低于48天齡的仔魚中沒有免疫陽性反應。
　　3.采用熒光定量 PCR技術檢測了 Dmrt2基因的兩個亞型

7、 Dmrt2a和Dmrt2b在金魚不同發(fā)育時期以及不同組織中的表達情況,用RACE技術克隆得到金魚 Dmrt2a cDNA序列的全長為1755 bp,5'和3'非編碼區(qū)長分別為188 bp和67 bp,推測的開放閱讀框可編碼499個氨基酸的多肽。分子系統(tǒng)進化分析表明金魚 Dmrt2a與其它魚類 Dmrt2a基因聚成一支,與斑馬魚(Danio rerio)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、青鳉(Oryzias latip

8、es)、羅非魚(Oreochromis Niloticus)Dmrt2a的同源性分別為85％、61%、58%、58%。熒光定量 PCR結果揭示,Dmrt2a在精巢中表達量最高,在卵巢中次之,而 Dmrt2b在卵巢中表達量最高,在精巢中次之,二者在腎臟、消化道、肝臟、心臟和腦中都有表達,但表達量低;不同發(fā)育時期胚胎和仔魚的Dmrt2a和Dmrt2b表達量差異很大,Dmrt2a在受精后24 h達到最高值,之后表達量降低,而 Dmrt2b在孵