基于Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)快速構(gòu)建不同基因型乙型肝炎病毒穩(wěn)定整合細(xì)胞株方法的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是全球范圍內(nèi)的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。HBV為嗜肝病毒，只能在肝細(xì)胞中增殖，目前HBV復(fù)制與抑制相關(guān)的研究大多采用HBV質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh7或HepG2細(xì)胞的方法，但在進(jìn)行藥物篩查、病毒制備等需要穩(wěn)定均一的實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，穩(wěn)定整合細(xì)胞株是更好的選擇。HepG2.2.15和HepAD38是當(dāng)前用于HBV研究的最常用的兩株細(xì)胞株，其構(gòu)建策略為隨機(jī)整合方式，且這兩株細(xì)胞株均為Genotype

2、 D型。有研究表明，不同基因型乙型肝炎病毒有不同的地理分布特征，在復(fù)制、感染、耐藥、突變等方面有所差異，對(duì)于疾病的進(jìn)展、治療應(yīng)答和預(yù)后轉(zhuǎn)歸有不同的提示意義，因此在綜合全面研究HBV時(shí)，需要對(duì)不同基因型的HBV進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子是一種高效穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移工具，它能通過(guò)“剪切-粘貼”的方式將外源目的基因整合入宿主細(xì)胞基因組中，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)利用Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子構(gòu)建HBV穩(wěn)定整合細(xì)胞株的報(bào)

3、道。本研究設(shè)計(jì)搭建了一種新型的攜帶Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子（包括ITRs正反向重復(fù)序列和SB100X轉(zhuǎn)座酶元件）、熒光報(bào)告基因(mCherry)、真核抗性基因（Puro嘌呤霉素）的ALL-IN-ONE載體并命名為pTsmP。從臨床血清樣本中提取了不同基因型的HBV序列連入pTsmP載體中，構(gòu)建篩選了不同基因型的穩(wěn)定整合乙型肝炎病毒細(xì)胞株，最終選取了最為常見(jiàn)的GenotypeA、B、C、D四型細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)研究，Souther

4、n/Northern Blot、CLEIA檢測(cè)與間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明經(jīng)過(guò)數(shù)十代傳代培養(yǎng)，不同基因型的細(xì)胞株均穩(wěn)定復(fù)制轉(zhuǎn)錄且在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)HBsAg、HBeAg和HBcAg等病毒蛋白。恩替卡韋(Entecavir，ETV)體外藥物阻斷試驗(yàn)結(jié)果顯示，所制備的四型HBV均對(duì)ETV有較好的敏感性。
　　綜上所述，本研究成功設(shè)計(jì)了基于Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)快速構(gòu)建不同基因型HBV穩(wěn)定整合細(xì)胞株的方法，并驗(yàn)證了其可