構(gòu)建YMDD變異乙型肝炎病毒穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 乙型肝炎病毒(HBV)感染是一種嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的全球性疾病。它可導(dǎo)致各種急、慢性疾病，包括致命的重型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等。目前治療慢性乙型肝炎(CHB)的抗病毒藥物主要有干擾素及核苷(酸)類(lèi)似物兩大類(lèi)。核苷(酸)類(lèi)似物進(jìn)入體內(nèi)后通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)摻入，取代病毒復(fù)制過(guò)程中延長(zhǎng)聚合酶鏈所需的與之結(jié)構(gòu)相似的核苷酸，由于核苷(酸)類(lèi)似物缺乏3'端羥基而不能繼續(xù)延伸DNA鏈，從而抑制病毒復(fù)制。但是由于核苷(酸)類(lèi)似物對(duì)作為復(fù)制模板

2、的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)無(wú)作用，核苷(酸)類(lèi)似物僅能抑制HBV復(fù)制而不能完全清除HBV，因此CHB患者需要長(zhǎng)時(shí)間服用核苷(酸)類(lèi)似物治療以抑制病毒復(fù)制。然而長(zhǎng)期服用核苷(酸)類(lèi)似物有可能出現(xiàn)病毒變異而導(dǎo)致耐藥問(wèn)題。其耐藥的基礎(chǔ)是復(fù)制過(guò)程中，HBV需要利用自身的DNA聚合酶將前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，由于HBV聚合酶沒(méi)有校正活性，容易出現(xiàn)錯(cuò)配而導(dǎo)致突變。核苷(酸)類(lèi)似物作用于HBV的聚合酶區(qū)，而聚合酶區(qū)基因突變可能導(dǎo)致某些

3、特定部位的氨基酸被置換，使之與藥物的結(jié)合力下降，從而出現(xiàn)藥物敏感性降低和耐藥。拉米夫定耐藥的變異為HBVDNA聚合酶基因P區(qū)第739個(gè)核苷酸A突變?yōu)镚，使第204位的蛋氨酸被纈氨酸替代(rtM204V)，即YMDD突變?yōu)閅VDD，且往往同時(shí)還伴有第180位的亮氨酸被蛋氨酸所置換(rtL180M)的變異。核苷(酸)類(lèi)似物耐藥為目前慢性乙型肝炎抗病毒治療中所面臨的主要難題之一，因此有必要建立核苷(酸)類(lèi)似物耐藥模型用于抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)、篩選

4、、耐藥機(jī)理的研究。由于HBV感染有高度的種屬和組織特異性，僅感染人和猩猩，而猩猩價(jià)格昂貴，來(lái)源困難，故動(dòng)物模型缺乏。在HBV相關(guān)研究中，多使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型由于動(dòng)物本身的免疫狀態(tài)及遺傳背景尚不十分明確，其使用受到限制。目前體外細(xì)胞培養(yǎng)模型主要有三大類(lèi)：第一類(lèi)是HBV直接感染細(xì)胞模型；第二類(lèi)是不產(chǎn)生基因整合的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型；第三類(lèi)足HBV基因與細(xì)胞基因組基因整合并持續(xù)產(chǎn)生HBV顆粒的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。感染模型

5、的細(xì)胞來(lái)源困難，難以長(zhǎng)期培養(yǎng)，使用較少。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型缺點(diǎn)仍為不能長(zhǎng)期培養(yǎng)，同時(shí)受實(shí)驗(yàn)條什影響大。基于耐藥研究、藥物篩選及評(píng)價(jià)方面的考慮，細(xì)胞模型需要穩(wěn)定分泌出耐藥HBV病毒顆粒。目前國(guó)外已有構(gòu)建此類(lèi)細(xì)胞株及相關(guān)的研究，但尚無(wú)公認(rèn)、廣泛使用的商品化穩(wěn)定表達(dá)耐藥HBV細(xì)胞株，因此有必要建立穩(wěn)定表達(dá)耐藥HBV體外細(xì)胞模型。 將DNA有效整合入細(xì)胞基因組，其方法主要有非病毒載體法及病毒載體法。前者包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電擊穿孔

6、法及顯微注射法等，這些方法得到穩(wěn)定細(xì)胞株的效率相當(dāng)?shù)汀：笳咧饕悄孓D(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、單純皰疹病毒載體、慢病毒載體等方法。其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及慢病毒載體對(duì)目的基因轉(zhuǎn)移效率高，容易得到穩(wěn)定表達(dá)株。 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為基于逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建的病毒載體。在構(gòu)建時(shí)，刪去了pol、env和gag基因，保留了5'端和3'端的LTR及包裝信號(hào)ψ序列，并增加了多克隆位點(diǎn)、抗性標(biāo)記，與質(zhì)粒拼接而成。而病毒顆粒識(shí)別、包裝等過(guò)程所必須的gag、pol

7、與env基因整合在相應(yīng)的包裝細(xì)胞基因組內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后，將載體DNA插入包裝細(xì)胞基因組。載體DNA轉(zhuǎn)錄出含標(biāo)記基因、目的基因、包裝信號(hào)的RNA序列，結(jié)合包裝細(xì)胞內(nèi)已提供gag、pol與env蛋白，包裝出有感染能力的假病毒顆粒。這種假病毒顆?？筛腥景屑?xì)胞，并將整條病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA上，使之成為其一部分，并能穩(wěn)定表達(dá)目的基因。 研究目的： 構(gòu)建含rtM204V、rtL180M突變位點(diǎn)的拉米夫定

8、耐藥1.3拷貝HBV基因及其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的方法建立表達(dá)YMDD變異HBV的穩(wěn)定細(xì)胞株，并進(jìn)一步鑒定所構(gòu)建細(xì)胞株HBV復(fù)制及抗原表達(dá)情況。通過(guò)本研究探索構(gòu)建其他核苷(酸)類(lèi)似物耐藥HBV穩(wěn)定細(xì)胞株的方法。 研究方法： 1.使用突變引物YVS、YVA對(duì)重組桿狀病毒載體上的1.3拷貝野生株HBV的進(jìn)行rtM204V定點(diǎn)突變。通過(guò)突變引物526MS、526MA對(duì)目的基因進(jìn)行rtL180M位點(diǎn)突變。P

9、CR-RFLP鑒定突變是否成功。攜帶已經(jīng)突變的目的基因的桿狀病毒重組載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以測(cè)定目的基因復(fù)制活性。 2.攜帶1.3拷貝拉米夫定耐藥HBV基因的重組桿狀病毒載體質(zhì)粒與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX2分別進(jìn)行HindⅢ、SalⅠ雙酶切。純化回收目的片段進(jìn)行連接，獲得含反向目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRV-oYVDDHBV。通過(guò)引物HSS和HSA擴(kuò)增出1.3拷貝拉米夫定耐藥HBV基因，并使得PCR產(chǎn)物5'端帶有HindⅢ位點(diǎn)，3

10、'端帶有SalⅠ位點(diǎn)，經(jīng)酶切、連接后獲得含正向目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRV-YVDDHBV。使用酶切、PCR及測(cè)序的方法鑒定所構(gòu)建重組載體。 3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PT67包裝細(xì)胞，含G418培養(yǎng)基壓力篩選后挑取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆，獲得含病毒培養(yǎng)上清。 4.倍比稀釋含重組病毒顆粒的包裝細(xì)胞培養(yǎng)上清，梯度濃度的含病毒上清感染NIH3T3細(xì)胞，含G418培養(yǎng)基壓力篩選，以確定病毒滴度。取經(jīng)感染并篩選后仍存活的

11、NIH3T3細(xì)胞，其培養(yǎng)上清再次感染新復(fù)蘇的NIH3T3細(xì)胞，G418壓力篩選以確定有無(wú)輔助病毒存在。 5.含重組病毒顆粒的包裝細(xì)胞培養(yǎng)上清感染HepG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，挑取穩(wěn)定細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，最終獲得經(jīng)單克隆分化成長(zhǎng)起的細(xì)胞株。Abbott化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)HepG2-YVDDHBV培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg的表達(dá)，熒光定量法檢測(cè)上清HBVDNA，免疫組化檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)，鑒定上

12、清中HBV復(fù)制及抗原表達(dá)情況，測(cè)序鑒定HBV耐藥變異情況。 研究結(jié)果： 1.PCR-RFLP的方法鑒定rtM204V突變成功。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多克隆位點(diǎn)兩端引物進(jìn)行PCR及測(cè)序，證實(shí)定點(diǎn)突變成功。攜帶已經(jīng)突變的目的基因的桿狀病毒重組載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，ELISA方法檢測(cè)HBsAg及HBeAg的表達(dá)均陽(yáng)性。 2.HindⅢ及SalⅠ雙酶切重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多克隆位點(diǎn)兩端引物PCR檢測(cè)，兩種方

13、法均證實(shí)正向插入耐藥HBV基因及反向插入耐藥HBV基因兩種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建成功。 3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞并經(jīng)過(guò)2周G418壓力篩選，得到產(chǎn)病毒包裝細(xì)胞多株。選取正向和反向插入目的基因兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各一株行病毒滴度滴定。G418篩選10天后，106倍濃度稀釋上清所感染的培養(yǎng)孔則均無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)，而此濃度下感染的培養(yǎng)孔內(nèi)則有細(xì)胞克隆存在，考慮病毒滴度均約在1×105CFU/ml。經(jīng)檢測(cè)無(wú)輔助病毒存在。 4.含反向

14、插入1.3拷貝HBV基因的重組病毒上清感染HepG2細(xì)胞并行G418篩選，獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株常規(guī)ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg均為陰性。 5.含正向插入1.3拷貝耐藥HBV基因的病毒上清感染HepG2細(xì)胞，共篩選出7株HBsAg及HBeAg均表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞克隆。挑取其中表達(dá)較高一株繼續(xù)培養(yǎng)并行進(jìn)一步鑒定，命名為HepG2-YVDDHBV。同時(shí)在未突變野生株HBV病毒實(shí)驗(yàn)對(duì)照組篩選出一株命名為HepG2-WHBV

15、。 6.檢測(cè)HepG2一YVDDHBV培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg的表達(dá)及HBVDNA定量，2.2.15細(xì)胞株及未突變野生株HepG2-WHBV作為對(duì)照。結(jié)果均為陽(yáng)性，但HepG2-sYVDDHBV的HBsAg、HBeAg表達(dá)及HBVDNA復(fù)制與2.2.15細(xì)胞株相比均明顯低。持續(xù)培養(yǎng)8周HepG2-YVDDHBV細(xì)胞株培養(yǎng)上清的HBsAg、HBeAg均有持續(xù)表達(dá)。 7.免疫組化檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)，結(jié)果顯示

16、HepG2-YVDDHBV細(xì)胞內(nèi)HBcAg陽(yáng)性。 研究結(jié)論： 成功構(gòu)建了含rtM204V/rtL180M位點(diǎn)突變的1.3拷貝拉米夫定耐藥HBV基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。成功將重組載體轉(zhuǎn)染PT67包裝細(xì)胞，獲得感染性重組病毒顆粒。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒找體系統(tǒng)的方法，建立了含rtM204V/rtL180M變異HBV基因的穩(wěn)定細(xì)胞株HepG2-YVDDHBV。經(jīng)檢測(cè)其HBsAg及HBeAg的表達(dá)均陽(yáng)性，免疫組化可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)HBcA