構(gòu)建YMDD變異乙型肝炎病毒穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 乙型肝炎病毒(HBV)感染是一種嚴(yán)重影響人類健康的全球性疾病。它可導(dǎo)致各種急、慢性疾病，包括致命的重型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等。目前治療慢性乙型肝炎(CHB)的抗病毒藥物主要有干擾素及核苷(酸)類似物兩大類。核苷(酸)類似物進(jìn)入體內(nèi)后通過競爭摻入，取代病毒復(fù)制過程中延長聚合酶鏈所需的與之結(jié)構(gòu)相似的核苷酸，由于核苷(酸)類似物缺乏3'端羥基而不能繼續(xù)延伸DNA鏈，從而抑制病毒復(fù)制。但是由于核苷(酸)類似物對作為復(fù)制模板

2、的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)無作用，核苷(酸)類似物僅能抑制HBV復(fù)制而不能完全清除HBV，因此CHB患者需要長時(shí)間服用核苷(酸)類似物治療以抑制病毒復(fù)制。然而長期服用核苷(酸)類似物有可能出現(xiàn)病毒變異而導(dǎo)致耐藥問題。其耐藥的基礎(chǔ)是復(fù)制過程中，HBV需要利用自身的DNA聚合酶將前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，由于HBV聚合酶沒有校正活性，容易出現(xiàn)錯(cuò)配而導(dǎo)致突變。核苷(酸)類似物作用于HBV的聚合酶區(qū)，而聚合酶區(qū)基因突變可能導(dǎo)致某些

3、特定部位的氨基酸被置換，使之與藥物的結(jié)合力下降，從而出現(xiàn)藥物敏感性降低和耐藥。拉米夫定耐藥的變異為HBVDNA聚合酶基因P區(qū)第739個(gè)核苷酸A突變?yōu)镚，使第204位的蛋氨酸被纈氨酸替代(rtM204V)，即YMDD突變?yōu)閅VDD，且往往同時(shí)還伴有第180位的亮氨酸被蛋氨酸所置換(rtL180M)的變異。核苷(酸)類似物耐藥為目前慢性乙型肝炎抗病毒治療中所面臨的主要難題之一，因此有必要建立核苷(酸)類似物耐藥模型用于抗病毒藥物的開發(fā)、篩選

4、、耐藥機(jī)理的研究。由于HBV感染有高度的種屬和組織特異性，僅感染人和猩猩，而猩猩價(jià)格昂貴，來源困難，故動(dòng)物模型缺乏。在HBV相關(guān)研究中，多使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型由于動(dòng)物本身的免疫狀態(tài)及遺傳背景尚不十分明確，其使用受到限制。目前體外細(xì)胞培養(yǎng)模型主要有三大類：第一類是HBV直接感染細(xì)胞模型；第二類是不產(chǎn)生基因整合的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型；第三類足HBV基因與細(xì)胞基因組基因整合并持續(xù)產(chǎn)生HBV顆粒的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。感染模型

5、的細(xì)胞來源困難，難以長期培養(yǎng)，使用較少。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型缺點(diǎn)仍為不能長期培養(yǎng)，同時(shí)受實(shí)驗(yàn)條什影響大。基于耐藥研究、藥物篩選及評價(jià)方面的考慮，細(xì)胞模型需要穩(wěn)定分泌出耐藥HBV病毒顆粒。目前國外已有構(gòu)建此類細(xì)胞株及相關(guān)的研究，但尚無公認(rèn)、廣泛使用的商品化穩(wěn)定表達(dá)耐藥HBV細(xì)胞株，因此有必要建立穩(wěn)定表達(dá)耐藥HBV體外細(xì)胞模型。 將DNA有效整合入細(xì)胞基因組，其方法主要有非病毒載體法及病毒載體法。前者包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電擊穿孔

6、法及顯微注射法等，這些方法得到穩(wěn)定細(xì)胞株的效率相當(dāng)?shù)汀：笳咧饕悄孓D(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、單純皰疹病毒載體、慢病毒載體等方法。其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及慢病毒載體對目的基因轉(zhuǎn)移效率高，容易得到穩(wěn)定表達(dá)株。 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為基于逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建的病毒載體。在構(gòu)建時(shí)，刪去了pol、env和gag基因，保留了5'端和3'端的LTR及包裝信號(hào)ψ序列，并增加了多克隆位點(diǎn)、抗性標(biāo)記，與質(zhì)粒拼接而成。而病毒顆粒識(shí)別、包裝等過程所必須的gag、pol

7、與env基因整合在相應(yīng)的包裝細(xì)胞基因組內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后，將載體DNA插入包裝細(xì)胞基因組。載體DNA轉(zhuǎn)錄出含標(biāo)記基因、目的基因、包裝信號(hào)的RNA序列，結(jié)合包裝細(xì)胞內(nèi)已提供gag、pol與env蛋白，包裝出有感染能力的假病毒顆粒。這種假病毒顆?？筛腥景屑?xì)胞，并將整條病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA上，使之成為其一部分，并能穩(wěn)定表達(dá)目的基因。 研究目的： 構(gòu)建含rtM204V、rtL180M突變位點(diǎn)的拉米夫定

8、耐藥1.3拷貝HBV基因及其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的方法建立表達(dá)YMDD變異HBV的穩(wěn)定細(xì)胞株，并進(jìn)一步鑒定所構(gòu)建細(xì)胞株HBV復(fù)制及抗原表達(dá)情況。通過本研究探索構(gòu)建其他核苷(酸)類似物耐藥HBV穩(wěn)定細(xì)胞株的方法。 研究方法： 1.使用突變引物YVS、YVA對重組桿狀病毒載體上的1.3拷貝野生株HBV的進(jìn)行rtM204V定點(diǎn)突變。通過突變引物526MS、526MA對目的基因進(jìn)行rtL180M位點(diǎn)突變。P

9、CR-RFLP鑒定突變是否成功。攜帶已經(jīng)突變的目的基因的桿狀病毒重組載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以測定目的基因復(fù)制活性。 2.攜帶1.3拷貝拉米夫定耐藥HBV基因的重組桿狀病毒載體質(zhì)粒與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX2分別進(jìn)行HindⅢ、SalⅠ雙酶切。純化回收目的片段進(jìn)行連接，獲得含反向目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRV-oYVDDHBV。通過引物HSS和HSA擴(kuò)增出1.3拷貝拉米夫定耐藥HBV基因，并使得PCR產(chǎn)物5'端帶有HindⅢ位點(diǎn)，3

10、'端帶有SalⅠ位點(diǎn)，經(jīng)酶切、連接后獲得含正向目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRV-YVDDHBV。使用酶切、PCR及測序的方法鑒定所構(gòu)建重組載體。 3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PT67包裝細(xì)胞，含G418培養(yǎng)基壓力篩選后挑取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆，獲得含病毒培養(yǎng)上清。 4.倍比稀釋含重組病毒顆粒的包裝細(xì)胞培養(yǎng)上清，梯度濃度的含病毒上清感染NIH3T3細(xì)胞，含G418培養(yǎng)基壓力篩選，以確定病毒滴度。取經(jīng)感染并篩選后仍存活的

11、NIH3T3細(xì)胞，其培養(yǎng)上清再次感染新復(fù)蘇的NIH3T3細(xì)胞，G418壓力篩選以確定有無輔助病毒存在。 5.含重組病毒顆粒的包裝細(xì)胞培養(yǎng)上清感染HepG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，挑取穩(wěn)定細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，最終獲得經(jīng)單克隆分化成長起的細(xì)胞株。Abbott化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀檢測HepG2-YVDDHBV培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg的表達(dá)，熒光定量法檢測上清HBVDNA，免疫組化檢測細(xì)胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)，鑒定上

12、清中HBV復(fù)制及抗原表達(dá)情況，測序鑒定HBV耐藥變異情況。 研究結(jié)果： 1.PCR-RFLP的方法鑒定rtM204V突變成功。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多克隆位點(diǎn)兩端引物進(jìn)行PCR及測序，證實(shí)定點(diǎn)突變成功。攜帶已經(jīng)突變的目的基因的桿狀病毒重組載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，ELISA方法檢測HBsAg及HBeAg的表達(dá)均陽性。 2.HindⅢ及SalⅠ雙酶切重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多克隆位點(diǎn)兩端引物PCR檢測，兩種方

13、法均證實(shí)正向插入耐藥HBV基因及反向插入耐藥HBV基因兩種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建成功。 3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞并經(jīng)過2周G418壓力篩選，得到產(chǎn)病毒包裝細(xì)胞多株。選取正向和反向插入目的基因兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各一株行病毒滴度滴定。G418篩選10天后，106倍濃度稀釋上清所感染的培養(yǎng)孔則均無細(xì)胞生長，而此濃度下感染的培養(yǎng)孔內(nèi)則有細(xì)胞克隆存在，考慮病毒滴度均約在1×105CFU/ml。經(jīng)檢測無輔助病毒存在。 4.含反向

14、插入1.3拷貝HBV基因的重組病毒上清感染HepG2細(xì)胞并行G418篩選，獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株常規(guī)ELISA法檢測培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg均為陰性。 5.含正向插入1.3拷貝耐藥HBV基因的病毒上清感染HepG2細(xì)胞，共篩選出7株HBsAg及HBeAg均表達(dá)陽性的細(xì)胞克隆。挑取其中表達(dá)較高一株繼續(xù)培養(yǎng)并行進(jìn)一步鑒定，命名為HepG2-YVDDHBV。同時(shí)在未突變野生株HBV病毒實(shí)驗(yàn)對照組篩選出一株命名為HepG2-WHBV

15、。 6.檢測HepG2一YVDDHBV培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg的表達(dá)及HBVDNA定量，2.2.15細(xì)胞株及未突變野生株HepG2-WHBV作為對照。結(jié)果均為陽性，但HepG2-sYVDDHBV的HBsAg、HBeAg表達(dá)及HBVDNA復(fù)制與2.2.15細(xì)胞株相比均明顯低。持續(xù)培養(yǎng)8周HepG2-YVDDHBV細(xì)胞株培養(yǎng)上清的HBsAg、HBeAg均有持續(xù)表達(dá)。 7.免疫組化檢測細(xì)胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)，結(jié)果顯示

16、HepG2-YVDDHBV細(xì)胞內(nèi)HBcAg陽性。 研究結(jié)論： 成功構(gòu)建了含rtM204V/rtL180M位點(diǎn)突變的1.3拷貝拉米夫定耐藥HBV基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。成功將重組載體轉(zhuǎn)染PT67包裝細(xì)胞，獲得感染性重組病毒顆粒。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒找體系統(tǒng)的方法，建立了含rtM204V/rtL180M變異HBV基因的穩(wěn)定細(xì)胞株HepG2-YVDDHBV。經(jīng)檢測其HBsAg及HBeAg的表達(dá)均陽性，免疫組化可檢測到細(xì)胞內(nèi)HBcA