漢坦病毒S片段編碼產(chǎn)物在流行性出血熱早期診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、流行性出血熱是由漢坦病毒感染引起的一種急性傳染病,臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、休克、出血、急性腎功能衰竭等癥狀。自1978年李鎬汪等從疫區(qū)的黑線(xiàn)姬鼠肺組織中分離到漢坦病毒76-118株以來(lái),各國(guó)學(xué)者相繼分離到不同型別的漢坦病毒。目前漢坦病毒已鑒定出多種型別:姬鼠型(Hantaan HTN),家鼠型(SeoulSEO),(Puumala PUU),(Sin Nombre SNN),(Dobrave DOB)等,在我國(guó)主要流行HTN和SEO2種型別。

2、我國(guó)每年發(fā)病人數(shù)4—7萬(wàn),是世界上出血熱的高發(fā)區(qū),目前缺乏特異的治療方法,因此,對(duì)流行性出血熱的早期診斷和及時(shí)防治非常重要。
　　 漢坦病毒是分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒,是布尼亞病毒科中一個(gè)獨(dú)立的屬,該病毒的基因由大L(6530—6550核苷酸),中M(3613—3707核苷酸),S(1696—2083核苷酸)三個(gè)RNA片段組成,這三個(gè)片段分別編碼:依賴(lài)RNA的RNA聚合酶,糖蛋白G1和G2,核蛋白。其中核蛋白在不同型別之間具有較高

3、的同源性,可以誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答與細(xì)胞免疫應(yīng)答。研究表明,其中核衣殼蛋白具有很強(qiáng)的抗原性和免疫原性,是早期診斷的最佳抗原。
　　 本文旨在探討NP的抗原性,選擇S片段的最佳抗原位點(diǎn)體外構(gòu)建并表達(dá)NP,并將表達(dá)好的NP用于熒光定量PCR(RT—PCR),免疫滴金法(CGIDA),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),對(duì)病人血清進(jìn)行早期診斷。對(duì)臨床及流行病學(xué)及早、準(zhǔn)確地診斷、治療漢坦病毒引起的流行性出血熱至關(guān)重要。
　　 一.漢坦病毒

4、RT-PCR檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建及其在早期診斷中的應(yīng)用研究
　　 為了對(duì)漢坦病毒進(jìn)行早期的定性檢測(cè),同時(shí)對(duì)核衣殼蛋白(NP)的抗原性和免疫原性進(jìn)行進(jìn)一步的探討,采用76-118株的S片段構(gòu)建熒光定量PCR(RT—PCR)標(biāo)準(zhǔn)品,并建立以特異性熒光探針為特點(diǎn)的TaqMan熒光定量PCR方法用于早期檢測(cè)漢坦病毒核酸。首先對(duì)76-118株的S片段基因進(jìn)行序列分析,利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)引物和一條熒光探針,對(duì)病毒RNA進(jìn)行抽提,逆轉(zhuǎn)

5、錄為cDNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物純化后與PMD18-T Vector連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α,篩選得到標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)粒,提取質(zhì)粒并進(jìn)行定量。在S片段的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針,對(duì)real—time PCR條件進(jìn)行優(yōu)化,并提取急性期發(fā)病病人總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。同時(shí)用免疫熒光法(IFA)檢測(cè)這些急性期病人的抗體滴度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:該方法制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)熒光定量PCR擴(kuò)增證實(shí)構(gòu)建成功,應(yīng)用

6、于漢坦病毒早期檢測(cè),能對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制;應(yīng)用熒光定量PCR同時(shí)對(duì)急性期病人和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行病毒含量檢測(cè),保證了實(shí)驗(yàn)過(guò)程的一致性,具有高度特異性和靈敏度,從病毒核酸提取至檢測(cè)完成僅需3h左右,重復(fù)性好,并能在定性檢測(cè)的基礎(chǔ)上對(duì)病毒準(zhǔn)確定量。實(shí)驗(yàn)表明本研究建立的漢坦病毒熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品和TaqMan熒光定量PCR方法特異、敏感、快速,適用于漢坦病毒的早期檢測(cè)；同時(shí)進(jìn)一步證明了漢坦病毒S片段編碼的核衣殼蛋白(NP)是流行性出血熱早期診斷的理想

7、抗原。
　　 二.漢坦病毒S片段編碼蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)和純化
　　 為了制備特異性強(qiáng),靈敏度高的理想抗原,分段構(gòu)建漢坦病毒76-118株核蛋白S基因核心區(qū)域原核表達(dá)質(zhì)粒。首先從HTNV76—118株感染的Vero—E6細(xì)胞中提取總RNA作為模板,根據(jù)NCBI提供的76—118國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)序列設(shè)計(jì)引物,分3段進(jìn)行目的基因PCR反應(yīng),經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化、構(gòu)建了HTN型漢坦病毒S片段的核心區(qū)域表達(dá)載體pGEX-

8、4T-1-S1、pGEX-4T-1-S2、pGEX-4T-1-S3,并對(duì)重組產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示:重組產(chǎn)物的序列完全正確。
　　 對(duì)構(gòu)建的載體進(jìn)行原核表達(dá),首先進(jìn)行少量表達(dá),并用蛋白質(zhì)電泳和考馬斯亮藍(lán)染色,根據(jù)SDS—PAGE的結(jié)果顯示,只有N端(34bp-340bp)克隆片段長(zhǎng)度為334堿基,167氨基酸的表達(dá)載體pGEX-4T-1-S1在IPTG誘導(dǎo)下可表達(dá)。重組表達(dá)的蛋白存在于菌體包涵體中,重組表達(dá)的蛋白為167AA,約

9、12KD,GST的蛋白分子量為26KD,重組的融合蛋白總分子量為38KD。經(jīng)大量表達(dá)后用Western-blot將重組蛋白與單克隆抗體和HFRS患者的高效價(jià)血清進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)。在沉淀蛋白泳帶相對(duì)分子質(zhì)量38KD的位置,明顯可見(jiàn)一條蛋白條帶,與預(yù)計(jì)相對(duì)分子質(zhì)量相符,故可初步確定其為插入基因的表達(dá)產(chǎn)物,成功構(gòu)建了重組核蛋白原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-S1,獲得高純度的抗原。
　　 三.漢坦病毒重組核衣殼蛋白在流行性出血熱早期診

10、斷中的應(yīng)用
　　 流行性出血熱是由漢坦病毒引起的人類(lèi)急性傳染病,自HV成功分離以來(lái),對(duì)該病的血清學(xué)特異性診斷方法迅速建立,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)用于檢測(cè)病毒特異性的IgM和IgG抗體,用間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)HFRS患者血清特異性IgG和IgM抗體,以上兩種方法是目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室常用的方法,在急性感染中,特異性IgM的檢測(cè)以及雙份血清IgG效價(jià)增高4倍以上有利于診斷。免疫滴金法(CGIDA)曾成功地用于多種傳染病的檢

11、測(cè),具有操作簡(jiǎn)便,快速,及特異性高等特點(diǎn)。
　　 為了建立及推廣合適基層單位使用的特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的早期分型診斷和監(jiān)測(cè)方法,探索應(yīng)用重組漢坦病毒核蛋白(rNP)的免疫滴金法(CGIDA)對(duì)流行性出血熱的早期診斷價(jià)值。本研究采用純化的漢坦病毒核蛋白抗原,制備成CGIDA檢測(cè)試劑盒。在相同的CGIDA系統(tǒng)中,同時(shí)檢測(cè)流行性出血熱急性期病人血清,比較研究rNP與天然漢坦病毒蛋白(NP)的抗原功能。并與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EL