膽道感染細菌與機體相互作用機制的實驗研究.pdf

1、本文通過對引起膽道感染的大腸桿菌P菌毛的表達及papG粘附素基因的檢測，來明確膽道感染大腸桿菌的另一個特點一粘附特性；通過對急性重癥膽管炎大鼠模型多器官NF-kB、TLR-4、TLR-2的表達，來明確機體對病原微生物的先天和后天免疫防御反應，探討急性重癥膽管炎時多器官功能不全的機理，并對從感染的始動環(huán)節(jié)進行干預，減輕全身炎癥反應綜合癥和多器官功能不全提供理論依據(jù)。 實驗方法： 一、實驗對象 1.收集中國醫(yī)科大學附

2、屬盛京醫(yī)院臨床微生物室保留的從膽道感染病人膽汁內(nèi)培養(yǎng)出的大腸桿菌菌株34例及從健康志愿者糞便中分離出的大腸桿菌菌株8例，分別進行甘露醇抗性血凝試驗(MRHA)，并應用PCR法擴增所有菌株3型papG粘附素基因并進行分析比較。 2.Wistar大鼠，160-220g，雌雄不限。制成急性重癥膽管炎大鼠模型(膽道梗阻+E.coli)作為實驗組(36例)，單純膽道梗阻模型(膽道梗阻+Saline)作為對照組(18例)。 二、標本

3、采集 1.采集實驗組和對照組不同時點(1h、6h和24h)大鼠血標本、肝臟組織標本、肺臟組織標本和小腸組織標本。 2.一部分組織標本立即置入-80℃保存，待行RT-PCR和Western-Blot檢測；另一部分立即置入5％多聚甲醛溶液中固定，待行組織病理和免疫組織化學檢測。 三、檢測指標 1.P菌毛表達檢測：應用甘露糖抗性血凝試驗(MRHA)對42株大腸桿菌進行檢測，凡凝集當時或4℃過夜，觀察凝集反應呈≥

4、“++”者，判定為陽性。 2.papG粘附素基因檢測：應用PCR擴增，檢測42株大腸桿菌粘附素等位基因papGⅠ、papGⅡ、papGⅢ的表達情況。 3.血清炎癥介質(zhì)和細胞因子檢測：應用ELISA方法檢測實驗組和對照組不同時點血中“TNF-α、IL-10、IL-4濃度，表明全身炎癥反應強度。 4.肝臟、肺臟、回腸組織病理學檢測：檢測實驗組和對照組不同時點肝臟、肺臟、回腸組織病理學改變，表明組織病理學改變程度。

5、 5.NF-kB蛋白表達檢測：應用免疫組織化學方法檢測在肝臟、肺臟及小腸組織中的定位表達情況，應用Western-Blot方法檢測NF-kB在肝臟組織中的定量表達情況。 6.NF-kB mRNA表達檢測：應用RT-PCR方法檢測NF-kB mRNA在肝臟、肺臟及小腸組織中的定量表達情況。 7.TLR-4、TLR-2蛋白表達檢測：應用免疫組織化學方法檢測在肝臟、肺臟及小腸組織中的定位表達情況，應用Wegem-Blot方

6、法檢測TLR-4、TLR-2在肝臟組織中的定量表達情況。 8.TLR-4、TLR-2 mRNA表達檢測：應用RT-PCR方法檢測TLR-4、TLR-2mRNA在肝臟、肺臟及小腸組織中的定量表達情況。 實驗結果： 1.P菌毛表達檢測：膽道內(nèi)大腸桿菌P菌毛表達陽性率為47.06％(16/34)，顯著高于腸道內(nèi)大腸桿菌P菌毛表達陽性率0％(0/8)(p<0.05)。 2.papG粘附素基因檢測：膽道內(nèi)大腸桿菌粘

7、附素等位基因papGⅠ、papGⅡ、papGⅢ的表達陽性率分別為67.65％， 44.12％， 82.35％，其中papGⅢ顯著高于腸道內(nèi)大腸桿菌的表達陽性率37.5％(p<0.05)。 3.血清炎癥介質(zhì)和細胞因子檢測：實驗組外周血中TNF-α、IL-4水平術后1h即顯著升高，6h達到峰值，均顯著高于對照組，24h有所下降。IL-10濃度在術后1h即達到峰值，并顯著高于對照組，此后隨時間變化逐漸下降。 4.肝臟、肺臟、回

8、腸組織病理學檢測：肝臟實驗組1h組可見肝細胞濁腫，肝竇、肝細胞周圍及匯管區(qū)有少量炎細胞浸潤。6h組可見肝細胞濁腫明顯，排列疏松紊亂，明顯脂肪變性，有散在的點狀壞死灶，壞死灶內(nèi)較大量炎細胞浸潤；12h組病理改變同6h組，程度更嚴重，壞死灶較多，呈大片狀，膿腫形成，內(nèi)有大量炎細胞浸潤。肺臟實驗組1h組肺泡壁增厚，間質(zhì)滲出，少量炎細胞浸潤。6h組可見肺內(nèi)出血，肺間質(zhì)滲出增多，肺實變加重，較大量炎細胞浸潤；12h組病理改變同6h組，程度更嚴重，

9、可見有肺出血及膿腫、壞死灶形成?；啬c病理形態(tài)學改變不大，實驗組24h組可見小腸粘膜少量炎細胞浸潤。 5.NF-kB蛋白表達檢測：免疫組化發(fā)現(xiàn)重癥膽管炎大鼠術后1h、6h、24h可見肝細胞、肺上皮細胞、腸粘膜上皮細胞內(nèi)有棕色顆粒均勻分布于細胞漿，部分位于細胞核內(nèi)，其中以肝細胞6h組最為明顯。對照組大鼠相應組織則為陰性或僅有少量陽性染色細胞。Western-Blot方法檢測到重癥膽管炎和對照組大鼠術后肝組織NF-kB蛋白的表達，與相

10、應mRNA表達規(guī)律一致：重癥膽管炎大鼠NF-kB 在術后 6h顯著高于對照組(11805.67±2410.69 vs9888.67±244.85，p=0.026)。 6.NF-kB mRNA表達檢測：重癥膽管炎大鼠術后1h肝組織NF-kB mRNA即升高，6h達到高峰并顯著高于對照組(1.95±1.67 vs 0.75±0.22，p=0.001)，24h下降。肺組織NF-kB mRNA表達與肝一致。術后1h NF-kB mRNA

11、即升高，6h達到高峰并顯著高于對照組(1.69±0.36 vs 0.58±0.19，p=0.033)，24h下降。重癥膽管炎大鼠術后1h腸組織NF-kB mRNA即升高(0.38±0.16 vs 0.25±0.04，p=0.001)，6h達到高峰(0.86±0.34 VS 0.57±0.05，p=0.003)，24h下降(0.63±0.24 vs 0.25±0.05，p=0.011)，均顯著高于對照組。 7.TLR-4、TLR-

12、2蛋白表達檢測：應用免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn)對照組1h、6h、24h組肝臟、肺臟及小腸未見或僅有少量TLR-4和TLR-2表達。急性重癥膽管炎大鼠1h即可在肝臟、肺臟中表達，6h組表達最強，24h表達減弱。TLR-4和TLR-2表達均位于胞漿內(nèi)。Western-Blot方法檢測到重癥膽管炎和對照組大鼠術后肝組織TLR-2的表達隨時間的延長，表達逐漸增強，6h達到高峰(11278.50±1066.73 vs 8434±470.57，p=0.0

13、3)，24h略有下降但顯著高于對照組(10964.67 ±883.33 vs 8288.83±212.53，p=0.008)。重癥膽管炎和對照組大鼠術后肝組織TLR-4的表達與TLR-2一致，1h增高(8613.33±1999.22vs 6406.50±224.98，p=0.05)，6h達到峰值(11209.33 ±1271.09 vs 7287.33±240.78 p：0.12)，24h略有下降。 8.TLR-4、TLR-2

14、mRNA表達檢測：應用RT-PCR方法檢測到重癥膽管炎大鼠術后肝組織TLR-4mRNA術后1h即開始升高，6h達峰并顯著高于對照組(14.80±2.58 VS 9.30±1.08 p=0.002)，24h開始下降。肺組織TLR-4mRNA術后1h即開始升高，6h達峰，24h后輕度下降(8.02±1.32 VS 4.67±O．53p=0.037)。腸組織TLR-4mRNA表達與肝、肺組織相似，即術后1h即開始升高(8.25±2.14vs5

15、.01 ±0.68 p=0.05)，6h達峰，24h開始下降，但顯著高于對照組(7.89±3.14 VS 6.96±1.07 p=0.001)。重癥膽管炎大鼠術后肝組織TLR-2mRNA術后1h即開始升高(1.51±0.83 VS 1.18±O．25 p=0.002)，6h達峰，24h下降。肺組織TLR-2mRNA術后1h即開始升高，(10.13±5.20 VS5.54±1.12 p=0.001)，6h達峰(11.59±5.11 vs6

16、.89 ±1.07 p=0.001)， 24h后下降。腸組織TLR-2mRNA表達術后1h小時即開始升高，6h達峰(4.78±1.83vs2.05±1.40 p=0.002)，24h開始下降，但仍顯著高于對照組(4.52±1.30 VS 2.59±1.36 p=0.004)。 結論： 1.致膽道感染大腸桿菌P菌毛表達陽性率顯著高于正常腸道內(nèi)大腸桿菌； 2.致膽道感染大腸桿菌papG粘附素基因表達陽性率顯著高于正常