膽道閉鎖與病毒感染的動物實驗研究.pdf

1、研究背景與目的:膽道閉鎖是發(fā)生于嬰幼兒的進(jìn)行性炎癥性膽管病,最終導(dǎo)致肝外、肝內(nèi)膽管的梗阻及肝硬化。膽道閉鎖的病因和發(fā)病機制仍不清楚。來自臨床和動物實驗的證據(jù)提示圍生期的某種病毒感染誘發(fā)的宿主炎性反應(yīng)很可能是致病原因之一。其中,巨細(xì)胞病毒和輪狀病毒是膽道閉鎖研究中最受關(guān)注的兩種病毒。盡管研究發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖患兒有很高的巨細(xì)胞病毒感染率,但是臨床上仍缺乏足夠的證據(jù)表明這樣的感染與肝外膽道損傷繼而閉鎖存在直接的因果聯(lián)系。因此我們的研究目的之一是在

2、原有豚鼠先天性感染模型的基礎(chǔ)上,根據(jù)國內(nèi)高致病力毒株無法通過近交系傳代獲得的現(xiàn)狀,摸索圍產(chǎn)期遠(yuǎn)交系豚鼠巨細(xì)胞病毒(GuiFlea pig cytomegalovirus,gpCMV)感染并導(dǎo)致幼鼠肝膽損傷的合適病毒滴度,建立感染模型,并在此基礎(chǔ)上分析圍產(chǎn)期CMV感染后肝臟實質(zhì)和膽道系統(tǒng)的病變情況,進(jìn)一步了解CMV在膽道閉鎖發(fā)病中的作用;恒河猴輪狀病毒感染(Rhesus Rotavirus,RRV)的膽道閉鎖動物模型是目前膽道閉鎖研究中最

3、為常用的工具。由于輪狀病毒對反轉(zhuǎn)錄基因基因技術(shù)的抵抗,使得對該病毒致病分子生物學(xué)機制研究受到極大限制。本研究的第二部分?jǐn)M利用同組輪狀病毒混合感染后可發(fā)生基因重排的特性,篩選單基因重排病毒株,通過病毒株的表現(xiàn)型分析確定RRV致膽道損傷的關(guān)鍵致病基因節(jié)段及其致病機制。
　　材料與方法:一,豚鼠圍生期巨細(xì)胞病毒感染模型的建立及肝膽損傷機制研究:gpCMV于豚鼠胚胎肺成纖維細(xì)胞上傳代適應(yīng)。按病毒接種時間將動物分組為:1,孕晚期組,孕晚期豚

4、鼠于孕40-43天腹腔接種1×109TCID50病毒懸液,同時設(shè)生理鹽水或空白對照,活產(chǎn)子豚鼠出生后不同時間點處死取標(biāo)本。2,新生鼠組,隨機取新生豚鼠23只,于生后12-24小時腹腔注射1×108TCID50病毒懸液,于接種后不同時間點處死取標(biāo)本。3,幼鼠組,隨機取新生豚鼠16只,于生后10天腹腔注射1×108TCID50病毒懸液,于接種后不同時間點處死取標(biāo)本。觀察生長情況及黃疸癥狀。所有血液標(biāo)本常規(guī)肝功能檢測。肝臟及肝外膽道標(biāo)本石蠟切

5、片常規(guī)HE染色,原位檢測細(xì)胞凋亡情況。部分標(biāo)本冰凍切片原位雜交檢測gpCMVmRNA在肝膽系統(tǒng)的表達(dá)。膽汁標(biāo)本雙抗酶標(biāo)ELISA法檢測膽汁肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor,HGF)和白介素6(Inter]eukin6,IL-6)表達(dá)情況。免疫組化檢測CD8+細(xì)胞的表達(dá)。二,輪狀病毒致小鼠膽管損傷關(guān)鍵基因的研究:將毒性病毒株RRV與非毒性病毒株EDIM(EpiZOOtic Diarrhea ofInfant

6、 Mice)(體內(nèi))或TUCH(Tulane University and Cincinnati Childen’sHospi tal,新分離出的猴輪狀病毒株)(體外)共感染。所得部分雙基因或三基因重排子代與親代,或其他子代進(jìn)行回交或雜交以施加選擇性壓力。將培養(yǎng)所得病毒懸液接種MA104細(xì)胞系后瓊脂糖凝膠鋪板,挑選病毒斑。病毒純化后抽提RNA,聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行基因型分析。將所篩選出的單基因重排病毒株接種新生BALB/C小鼠,進(jìn)行病

7、毒致病性分析,部分小鼠接種后7天殺死取肝臟及肝外膽道標(biāo)本進(jìn)行組織病理分析。此外,將單基因重排各株接種膽管細(xì)胞系,4℃共孵育1小時后計算結(jié)合病毒量與總接種量的比例進(jìn)行病毒細(xì)胞結(jié)合力分析;重排病毒株接種膽管上皮細(xì)胞系,感染劑量MOI(Multiplicity of Infection)為1。48小時后對病毒進(jìn)行滴定,了解增殖情況。各重排克隆接種新生鼠后7天后取肝外膽道標(biāo)本制成勻漿,于MA104細(xì)胞系上進(jìn)行滴定,了解病毒負(fù)荷量。
　　結(jié)

8、果:
　　一,圍生期豚鼠巨細(xì)胞病毒感染模型建立及分析:
　　孕晚期及出生時腹腔接種巨細(xì)胞病毒可引起子代豚鼠肝膽系統(tǒng)損傷,表現(xiàn)為:
　　1,孕晚期感染豚鼠出生體重明顯低于鹽水及空白對照(P=0.0029,P=0027)。生后20天,體重增長也明顯落后于鹽水及空白對照。新生鼠及幼鼠組病毒接種后豚鼠體重增長較對照組相比無明顯差異。
　　2,孕晚期感染子豚鼠與空白及鹽水對照組相比,出生時及生后10天TB、DB、ALT、A

9、ST水平均明顯高于對照組(P＜0.05),出生時及生后10天兩組比較各指標(biāo)無明顯差異(P＞0.05),生后20天各指標(biāo)均明顯低于前兩組,較對照無明顯差別(P＞0.05)。部分子豚鼠肉眼可見大便變白,伴TB和DB水平的升高。新生鼠組病毒接種后10天AST水平較20天組和空白對照升高(P=0.027,P=0.043)。
　　3,63.6％的孕晚期感染子豚鼠肝臟存在單核淋巴細(xì)胞浸潤為主的炎癥/病理改變,炎性細(xì)胞浸潤以匯管區(qū)為主。可見小葉

10、間匯管區(qū)的破壞和纖維化改變,合并小膽管增生。伴有肝細(xì)胞氣球樣變性和壞死,肝內(nèi)膽汁淤積。偶可見肝內(nèi)微膿腫形成。新生鼠接種后10天出現(xiàn)肝臟病變(3/8),但病變較孕晚期組明顯減輕。幼鼠組未見明顯肝臟病變。
　　4,有肝膽損傷者肝內(nèi)細(xì)胞凋亡信號密度分布基本與炎癥浸潤程度一致,主要表達(dá)于肝臟實質(zhì)細(xì)胞和匯管區(qū)間質(zhì)細(xì)胞,血管和膽管上皮偶見信號表達(dá)。孕晚期組出生時肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)均值6.7±1.322,匯管區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)均值5.13±2.112

11、,與對照相比有明顯增加(P＜0.05),與新生鼠組肝損傷者凋亡指數(shù)無明顯差別。
　　5,病毒gpCMV陽性雜交信號表達(dá)于膽管上皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞及匯管區(qū)基質(zhì)內(nèi),但肝細(xì)胞內(nèi)未見表達(dá)。孕晚期組豚鼠gpCMV陽性率17.27％,而新生鼠及幼鼠組豚鼠肝膽系gpCMV-mRNA陽性率(55％,50％)均明顯高于孕晚期組(P=0.011,0.018＜0.05)。
　　6,新生鼠感染后10天,20天膽汁中可見HGF表達(dá)增加(P=0.0292

12、,P=0.0461.)。各組膽汁標(biāo)本中未見IL-6的表達(dá)。
　　7,孕晚期組(8/14)和新生鼠組(3/3)肝膽損傷者有CD8+細(xì)胞表達(dá),主要分布于肝臟實質(zhì)和匯管區(qū)間質(zhì)。
　　二,輪狀病毒致小鼠膽管損傷關(guān)鍵基因的研究:
　　1,在RRV對EDIM的體內(nèi)雜交中,得到單基因重排株4株,將EDIM背景單基因重排株D6/2接種新生鼠后(第4基因節(jié)段來自RRV),誘導(dǎo)出與RRV類似的膽管損傷癥狀。RRV對TUCH的體外混合感染中

13、(包括回交及子代雜交),分離出所有22個RRV或TUCH背景下單基因重排病毒株。分別命名為RTn(RRV背景重排株,第n個基因節(jié)段來自TIJCH)或TRn(TUCH背景重排株,第n個基因節(jié)段來自RRV)。N代表第1至11個基因節(jié)段。
　　2,致病性分析發(fā)現(xiàn):重排株RT4沒有致病性。相反,重排株TR4誘導(dǎo)出與RRV相似的黃疸癥狀,致病率(94.2％vs.100％,P=1.000)及致死率(88.24％vs.80.96％,P=1.00

14、0)無明顯差別。58.33％的RT3感染小鼠表現(xiàn)膽道梗阻癥狀,其致病率和致死率明顯低于RRV(p=0.001,0.000＜0.05)。相對應(yīng)的TR3盡管誘導(dǎo)出與RRV相似的致病率(88.89％,P=0.218),77.78％的小鼠最終黃疸癥狀消退并存活。其余RRV背景重排病毒株疾病的表現(xiàn)型與RRV類似。TR7、TR1和TR2一樣未誘導(dǎo)出任何肝膽損傷癥狀。其余大多數(shù)TUCH背景單基因重排株誘導(dǎo)一過性肝膽損傷癥狀,幾乎所有小鼠最終存活。

15、r>　　3,病理分析證實各重排株的疾病表現(xiàn)型與匯管區(qū)及肝外膽道病理改變密切相關(guān)。
　　4,細(xì)胞結(jié)合能力:重排株RT4的細(xì)胞結(jié)合率(3.97％±0.93％)明顯低于RRV(16.03％±1.31％,P=0.003＜0.05)及其他所有RRV背景重排株(P＜0.05)。其余RRV背景重排株細(xì)胞結(jié)合率與RRV無明顯差別(P＞0.05)。相反,重排株TR4(12.43％±2.25％)表現(xiàn)出明顯高于TUCH(5.33％±1.27％,p=0.

16、001)及所有其他TUCH背景重排株的細(xì)胞結(jié)合率(P＜0.05)。除了TR8和TR2外,其它TUCH背景重排株細(xì)胞結(jié)合率與TUCH相似(P＞0.05)。
　　5,感染性分析:克隆RT4在膽管上皮細(xì)胞系和肝外膽道的滴度均明顯低于RRV(P=0.013,0.000)。相對應(yīng)的克隆TR4的滴度無論在膽管細(xì)胞系還是小鼠肝外膽道均明顯高于TUCH(P=0.004,0.0446)。在膽管細(xì)胞系上,所有其它RRV背景重排株的滴度與RRV類似(P

17、＞0.05),在肝外膽道大部分低于RRV(P＜0.05)。TR7、TR1和TR2在膽管細(xì)胞系及肝外膽道滴度均低于TUCH(P=0.001,0.012,0.0069)。其余引起癥狀TUCH背景病重排株在膽管細(xì)胞系的滴度均高于TUCH(P＜0.05)。等級相關(guān)分析提示TUCH背景重排株在肝外膽道平均滴度與病毒致病率相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　一,圍生期豚鼠巨細(xì)胞病毒感染模型建立及分析:
　　1,孕晚期和出生后即刻接種gpCMN

18、病毒可導(dǎo)致子代豚鼠的感染和肝膽系統(tǒng)炎癥損傷。
　　2,肝內(nèi)和匯管區(qū)浸潤炎性細(xì)胞以單核淋巴細(xì)胞為主,伴有CD8+T細(xì)胞的表達(dá),提示Th1抗病毒免疫在此病理過程中發(fā)揮重要作用。
　　3,病毒mRNA主要表達(dá)于匯管區(qū)及內(nèi)皮系統(tǒng),證實了CMV病毒對膽管上皮的親和性。其攻擊膽管上皮標(biāo)本并引起炎癥損傷的機制待進(jìn)一步研究。
　　4,損傷主要發(fā)生于圍產(chǎn)期,與接種時間直接相關(guān),表明宿主免疫狀態(tài)不成熟可能是致病的重要背景因素。
　　

19、二,輪狀病毒致小鼠膽管損傷關(guān)鍵基因的研究:
　　1,基因節(jié)段4是決定小鼠膽道模型RRV對膽管上皮致病性的關(guān)鍵基因,也決定了RRV對膽管上皮感染的特異性,其機制在于影響病毒與膽管上皮細(xì)胞的結(jié)合能力,繼而影響病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,其蛋白產(chǎn)物VP4與膽管上皮相關(guān)受體的相互作用很可能是決定膽管細(xì)胞對病毒易感性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　2,基因節(jié)段7被替代后,病毒的致病性、細(xì)胞結(jié)合能力和膽管上皮復(fù)制均未受影響,其蛋白產(chǎn)物VP7相關(guān)細(xì)胞表面受體的表