RNF113A在哈薩克族食管鱗癌中的作用及其功能研究.pdf

1、目的：探討環(huán)指蛋白113A（RNF113A）基因參與食管癌細胞凋亡、增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響及在食管癌中的作用；通過分析哈族食管鱗癌組織中RNF113A表達水平與食管癌臨床惡性表型間的關(guān)系，為新疆哈薩克族食管癌臨床早期診斷及個體化治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：1）采用免疫組織化學(xué)法在組織水平檢測117例哈薩克族食管鱗癌組織及配對癌旁正常食管組織中RNF113A的表達，及RNF113A的表達與p53表達的關(guān)系；實時熒光定量

2、PCR（qRT-PCR）檢測41例哈族食管鱗癌組織及配對癌旁正常食管組織RNF113A的mRNA表達情況。分析RNF113A的表達與各臨床病理參數(shù)（患者年齡、性別、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織類型、腫瘤部位）的關(guān)系。分析RNF113A的表達與哈薩克族食管鱗癌預(yù)后的相關(guān)性；2）針對RNF113A的cDNA序列，我們合成了小干擾RNA（siRNA）和真核過表達載體，并轉(zhuǎn)染食管鱗狀細胞癌（ESCC）細胞系；運用qRT-PCR技術(shù)和wes

3、tern-blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染干擾和過表達載體后RNF113A表達水平的變化；運用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡；運用Transwell實驗和細胞劃痕實驗檢測RNF113A干擾和過表達后對ESCC細胞系遷移的變化，運用Transwell實驗檢測RNF113A干擾或過表達后ESCC細胞系侵襲的變化；3）構(gòu)建了RNF113A慢病毒干擾載體，轉(zhuǎn)染Eca109細胞，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RNF113A敲低的Eca109細胞系。分別將轉(zhuǎn)染有sh-scram

4、ble及sh-RNF113A細胞及正常培養(yǎng)的Eca109細胞接種于裸鼠皮下，構(gòu)建Eca109細胞裸鼠皮下荷瘤模型，每周稱重1次，并觀察瘤塊的生長情況。瘤塊長出后，用游標(biāo)卡尺測量裸鼠瘤塊長徑（A）及垂直橫徑（B），按公式V=A×B2/2計算裸鼠腫瘤體積，并繪制腫瘤體積增長曲線及體質(zhì)量曲線。處死后采用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測裸鼠瘤塊組織中RNF113A的表達。
　　結(jié)果：第一部分：免疫組織化學(xué)檢測RNF113A蛋白表達情況。

5、在117哈族ESCC組織中，74例（63.25％）RNF113A呈陽性表達，RNF113A在哈薩克族食管鱗癌組織中呈現(xiàn)高表達，明顯高于配對癌旁正常食管組織（P=0.000）。RNF113A和p53的表達在哈族食管鱗癌組織呈顯著正相關(guān)（P=0.035）。qRT-PCR檢測41例哈族食管鱗癌組織及配對癌旁正常食管組織RNF113A的mRNA表達情況，癌組織中表達量是癌旁正常組織中表達量均值的2倍。哈族食管癌組織中RNF113A表達與臨床病理

6、指標(biāo)間的相關(guān)性分析顯示，分化程度（P=0.008）和T分期（P=0.000）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.017）與RNF113A表達顯著相關(guān)，而RNF113A表達與性別、年齡、組織類型、腫瘤部位之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Kaplan Meier的生存曲線表明，RNF113A陰性表達的食管癌患者比RNF113A陽性表達的患者生存期長。采用Cox比例風(fēng)險單因素分析表明RNF113A表達和T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響哈族ESCC的預(yù)后因素。多因素分析表明R

7、NF113A表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是哈薩克族食管癌患者總生存率的獨立危險因素。第二部分：在體外ESCC細胞水平，沉默RNF113A基因后，G0/G1期細胞數(shù)顯著增加，S期細胞數(shù)顯著減少，G2/M期細胞顯著減少，抑制增殖；過表達RNF113A基因后，G0/G1期細胞數(shù)顯著減少，S期細胞數(shù)變化不明顯，G2/M期細胞顯著增加，促進增殖。RNF113A siRNA轉(zhuǎn)染Eca109及EC9706細胞后細胞凋亡率顯著上升；RNF113A過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，

8、各組間細胞凋亡率無差異。干擾RNF113A能抑制Eca109、EC9706細胞的遷移和侵襲能力；過表達RNF113A能顯著促進ESCC細胞的遷移和侵襲能力。第三部分：通過人食管癌Eca109細胞株裸鼠移植瘤動物模型的成功建立，結(jié)果顯示sh-RNF113A組裸鼠的瘤塊體積及重量都比對照組小，說明干擾RNF113A的表達后減緩了裸鼠的成瘤能力。sh-RNF113A組裸鼠瘤塊組織中RNF113A的蛋白和mRNA表達明顯降低，提示RNF113A