溫陽(yáng)補(bǔ)腎方治療激素性股骨頭壞死的臨床觀察和影響破骨細(xì)胞信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)臨床觀察溫陽(yáng)補(bǔ)腎方治療激素性股骨頭壞死的療效，并觀察溫陽(yáng)補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)破骨細(xì)胞TRACP活性、Cathepsin-K、MMP-9、RANK基因及培養(yǎng)上清液RANK、RANKL的影響，探討溫陽(yáng)補(bǔ)腎方對(duì)防治激素性股骨頭壞死的機(jī)理。
　　方法：
　　1、本課題臨床研究遵循隨機(jī)對(duì)照原則，對(duì)37例激素性股骨頭壞死患者進(jìn)行臨床觀察，其中治療組18例，對(duì)照組19例。治療組給予溫陽(yáng)補(bǔ)腎方;對(duì)照組給予仙靈骨葆膠囊。服藥

2、同時(shí)輔助功能鍛煉，并避免負(fù)重和長(zhǎng)距離行走。分別于治療前、治療后對(duì)患者進(jìn)行VAS、Harris評(píng)分并統(tǒng)計(jì)分析。
　　2、溫陽(yáng)補(bǔ)腎方含藥血清制備:將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組（對(duì)照組、溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低劑量組、中劑量組、高劑量組），每組15只。溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低劑量組(4.35g/kg·d)、中劑量組(8.70g/kg·d)、高劑量組（17.40g/kg·d）、對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃。每日早晚各一次，連續(xù)灌胃7天。末次灌胃1h后，制備溫

3、陽(yáng)補(bǔ)腎方含藥血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　3、40ng/mL RANKL和20ng/mL M-CSF誘導(dǎo)因子聯(lián)合誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞，2d換液一次。每天用倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況，TRAP染色鑒定破骨細(xì)胞。
　　4、各組加入溫陽(yáng)補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)后，酶動(dòng)力法測(cè)定各組破骨細(xì)胞上清液TRACP值。
　　5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)溫陽(yáng)補(bǔ)腎方對(duì)破骨細(xì)胞Cathepsin-K、MMP-9、RANKmRN

4、A表達(dá)的影響。
　　6、酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組上清液RANK、RANKL含量
　　7、免疫組化法檢測(cè)破骨細(xì)胞中RANK的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、臨床觀察結(jié)果示:溫陽(yáng)補(bǔ)腎方組和對(duì)照組均能增加Harris評(píng)分中功能評(píng)分，溫陽(yáng)補(bǔ)腎方組優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)，VAS評(píng)分、Harris其他各項(xiàng)評(píng)分的增加值及療效方面組間未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2、40 ng/mL RANKL和20 ng/mL

5、 M-CSF誘導(dǎo)因子聯(lián)合誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后，經(jīng) TRAP染色鑒定后，可獲得成熟破骨細(xì)胞。
　　3、與空白對(duì)照組相比，溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低、中、高劑量組在干預(yù)24h、48h時(shí)能使細(xì)胞上清液TRACP活性降低(P＜0.05）;中劑量組低于低劑量組、高劑量組(P＜0.05）;低劑量組與高劑量組(P＞0.05)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TRACP活性隨溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低、中、高劑量組含藥血清干預(yù)時(shí)間逐漸降低。
　　4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果提

6、示溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低劑量組、中劑量組和高劑量組可降低破骨細(xì)胞Cathepsin-K基因、MMP-9基因表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;溫陽(yáng)補(bǔ)腎方中劑量組＜高劑量組＜低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　5、ELISA法檢測(cè)結(jié)果提示溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低劑量組、中劑量組和高劑量組培養(yǎng)上清液中RANK含量與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);溫陽(yáng)補(bǔ)腎方高劑量組＜中劑量組＜低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;溫

7、陽(yáng)補(bǔ)腎方中劑量組與高劑量組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低劑量組、中劑量組和高劑量組上清液中RANKL含量與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;溫陽(yáng)補(bǔ)腎方中劑量組＜高劑量組＜低劑量組，三組組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　6、免疫組化法提示溫陽(yáng)補(bǔ)腎方可減少RANK表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;溫陽(yáng)補(bǔ)腎方高劑量組＜中劑量組＜低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　

8、　7、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低劑量組、中劑量組和高劑量組可降低RANK基因表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);溫陽(yáng)補(bǔ)腎方中劑量組＜高劑量組＜低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);溫陽(yáng)補(bǔ)腎方中劑量組與高劑量組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、溫陽(yáng)補(bǔ)腎方能有效改善激素性股骨頭壞死患者的生活質(zhì)量，減輕疼痛，療效確切。
　　2、溫陽(yáng)補(bǔ)腎方能明顯抑制破骨細(xì)胞活性。對(duì)破骨細(xì)胞性骨吸