溫陽(yáng)補(bǔ)腎方對(duì)兔激素性股骨頭壞死VEGF及RANKL-RANK-OPG通路的影響.pdf

1、目的：
　　通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，探討溫陽(yáng)補(bǔ)腎方對(duì)激素性股骨頭壞死組織VEGF及RANKL/RANK/OPG通路表達(dá)的影響，從分子水平探討溫陽(yáng)補(bǔ)腎方治療激素性股骨頭壞死的作用機(jī)制，為溫陽(yáng)補(bǔ)腎方的治則治法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、兔激素性股骨頭壞死模型的建立
　　1.1造模:用改進(jìn)的馬血清聯(lián)合甲強(qiáng)龍的方法，新西蘭大白兔精確稱(chēng)重，按10 mL·kg-1的劑量經(jīng)兔耳緣靜脈注射馬血清。間隔3周，按6mL·kg-1的

2、劑量再次注射馬血清。間隔2周后，按45 mg·kg-1的劑量腹腔注射甲基強(qiáng)的松龍，連續(xù)3天，每天一次。注射激素期間，每天每只大白兔腹腔注射青霉素10萬(wàn)單位，連續(xù)7天，預(yù)防感染。
　　1.2動(dòng)物模型鑒定:運(yùn)用空氣栓塞法處死，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察股骨近端骨組織和骨髓組織的骨小梁、骨髓造血組織、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的病理改變。若觀察到骨細(xì)胞部分核深染，較多的細(xì)胞核固縮，核偏位。骨小梁內(nèi)正常骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨陷窩內(nèi)骨細(xì)胞消失，空

3、骨陷窩數(shù)明顯增多，提示造模成功。
　　2、溫陽(yáng)補(bǔ)腎方對(duì)兔激素性股骨頭壞死股骨頭形態(tài)學(xué)及血清VEGF、RANKL、RANK、OPG含量的影響
　　2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn):136只新西蘭大白兔隨機(jī)分為5組:正常組、模型組、中藥低(6.44g/kg·d)、中(9.66 g/kg·d)、高(12.88 g/kg·d)劑量組（造模按改進(jìn)的馬血清聯(lián)合甲強(qiáng)龍的方法）。正常組和模型組每日用生理鹽水灌胃10mL。中藥治療組給予不同濃度的溫陽(yáng)補(bǔ)腎方進(jìn)行

4、灌胃。分別于給藥后第4、8、12周取雙側(cè)股骨頭、血清。
　　2.2指標(biāo)檢測(cè):股骨頭石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡下進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)定;計(jì)算空骨陷窩比率;行電子染色，透射電鏡觀察股骨頭壞死組織中骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變;運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清VEGF、RANKL、RANK、OPG的含量。
　　3、溫陽(yáng)補(bǔ)腎方對(duì)兔激素性股骨頭壞死組織VEGF及RANKL/RANK/OPG通路的影響
　　3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn):136只新

5、西蘭大白兔隨機(jī)分為5組:正常組、模型組、中藥低(6.44g/kg·d)、中(9.66 g/kg·d)、高(12.88 g/kg·d)劑量組（造模按改進(jìn)的馬血清聯(lián)合甲強(qiáng)龍的方法）。正常組和模型組每日用生理鹽水灌胃10mL。中藥治療組給予不同濃度的溫陽(yáng)補(bǔ)腎方進(jìn)行灌胃。根據(jù)實(shí)驗(yàn)二結(jié)果，選取給藥第8周所取材備用的股骨頭。
　　3.2指標(biāo)檢測(cè):分別提取股骨頭組織RNA和蛋白，RT-PCR法檢測(cè)VEGF及RANKL、RANK、OPG的mRNA

6、表達(dá)，Western-Blot法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、模型鑒定結(jié)果
　　成功建立了新西蘭大白兔SANFH模型。造模后大白兔四肢活動(dòng)減少，精神狀態(tài)萎靡，飲食飲水減少，大便減少，毛發(fā)光澤暗淡，甚至出現(xiàn)大量掉毛。體重明顯下降，皮下脂肪減少。股骨頭軟骨面顏色偏暗紅，表面光澤暗淡，觸摸略微粗糙，且骨質(zhì)較脆，截取容易。股骨頭石蠟切片HE染色見(jiàn)模型組股骨頭軟骨層變薄，部分軟骨面出現(xiàn)剝脫裂紋。骨小梁結(jié)構(gòu)松散不規(guī)則，

7、細(xì)長(zhǎng)而窄，甚至出現(xiàn)斷裂。軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞減少，且骨細(xì)胞腫大，出現(xiàn)較多的空骨陷窩，髓腔可見(jiàn)大量肥大的脂肪細(xì)胞，骨髓細(xì)胞減少，造模成功。
　　2、股骨頭石蠟切片HE染色觀察
　　溫陽(yáng)補(bǔ)腎方可改善SANFH股骨頭病理變化。模型組股骨頭軟骨層變薄，部分軟骨面出現(xiàn)剝脫裂紋。骨小梁結(jié)構(gòu)松散不規(guī)則，細(xì)長(zhǎng)而窄，甚至出現(xiàn)斷裂。軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞減少，且骨細(xì)胞腫大，出現(xiàn)較多的空骨陷窩，髓腔可見(jiàn)大量肥大的脂肪細(xì)胞，骨髓細(xì)胞減少。第4、8、12周時(shí)，

8、中藥低、中、高劑量組空骨陷窩率均明顯低于模型組。從各時(shí)間點(diǎn)顯示中藥組所用藥物劑量與空骨陷窩率成反比。各時(shí)間點(diǎn)低劑量、中劑量、高劑量中藥組之間差異明顯。
　　3、酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清VEGF、OPG、RANK、RANKL濃度
　　溫陽(yáng)補(bǔ)腎方可上調(diào)血清OPG含量下調(diào)血清RANKL、RANK含量。第4周時(shí)，中藥中、高劑量組VEGF、RANK、RANKL明顯低于模型組，而OPG明顯高于模型組。第8周、第12周時(shí)，中藥低、中、高劑量組V

9、EGF、RANK、RANKL明顯低于模型組，而OPG明顯高于模型組。以第8周作為變化明顯的時(shí)間點(diǎn)。
　　4、股骨頭壞死組織中骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察
　　溫陽(yáng)補(bǔ)腎方可改善SANFH壞死組織中骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。模型組骨細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)聚集甚至核碎裂，多被巨大脂滴壓縮到一側(cè)，細(xì)胞壞死凋亡形成空骨陷窩，周?chē)哪z原纖維粗大且紊亂。中藥低、中、高劑量治療后細(xì)胞結(jié)構(gòu)均有所好轉(zhuǎn)。
　　5、RT-PCR檢測(cè)股骨頭壞死組織VEGF及R

10、ANKL、RANK、OPG的mRNA表達(dá)
　　溫陽(yáng)補(bǔ)腎方可提高VEGF及OPG的mRNA表達(dá)，降低RANKL及RANK的mRNA表達(dá)。模型組股骨頭壞死組織VEGF與OPG的mRNA表達(dá)減低，RANK和RANKL的mRNA表達(dá)升高。中藥各劑量組VEGF與OPG的mRNA表達(dá)均升高，RANK和RANKL的mRNA表達(dá)均降低，且中、高劑量組比低劑量組升高更明顯，中、高劑量組之間無(wú)差異。用藥劑量與VEGF和OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正比

11、，與RANK和RANKL的mRNA表達(dá)呈反比。
　　6、Western-Blot檢測(cè)股骨頭壞死組織VEGF及RANKL、RANK、OPG蛋白的表達(dá)
　　溫陽(yáng)補(bǔ)腎方可提高VEGF及OPG的蛋白表達(dá)，降低RANKL及RANK的蛋白表達(dá)。模型組股骨頭壞死組織VEGF與OPG的蛋白表達(dá)減低，RANK和RANKL的蛋白表達(dá)升高。中藥各劑量組VEGF與OPG的蛋白表達(dá)均升高，RANK和RANKL的蛋白表達(dá)量有減低的趨勢(shì);且中、高劑量組比

12、低劑量組升高更明顯，中、高劑量組之間無(wú)差異。用藥劑量與VEGF和OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量呈正比，與RANK和RANKL的蛋白表達(dá)量呈反比。
　　7、VEGF與RANKL/RANK/OPG相關(guān)性
　　血液與組織的VEGF與RANKL/RANK/OPG相關(guān)性分析均提示:相關(guān)性在0.01水平上顯著（雙尾）。表明血液中與組織中VEGF表達(dá)均與OPG表達(dá)水平正相關(guān)，與RANKL、RANK表達(dá)負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、溫陽(yáng)補(bǔ)

13、腎方可提高VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)股骨頭內(nèi)血管新生，增強(qiáng)骨組織自身修復(fù)能力，發(fā)揮治療激素性骨頭壞死作用。
　　2、溫陽(yáng)補(bǔ)腎方可調(diào)節(jié)RANK/RANKL/OPG通路的功能，抑制破骨細(xì)胞的過(guò)度活化，使骨代謝恢復(fù)動(dòng)態(tài)平衡，能促進(jìn)新骨的形成，可能是治療激素性股骨頭壞死的機(jī)制之一。
　　3、血液中與組織中VEGF表達(dá)均與OPG表達(dá)水平正相關(guān)，與RANKL、RANK表達(dá)負(fù)相關(guān)。溫陽(yáng)補(bǔ)腎方治療SANFH取效的機(jī)制之一，可能是通過(guò)提高VEG