免疫系統(tǒng)和肝臟雙重建小鼠模型的建立.pdf

1、某些重大疾病的研究需要在體內(nèi)探究免疫系統(tǒng)對病原體感染、轉(zhuǎn)化以及破壞過的局部組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過程，而直接對疾病個體進行深入研究卻存在一定風險，MHC分子限制性的嵌合體小鼠將是一個最實用的模型。目前認為造血干細胞能在免疫缺陷或是致死照射的小鼠體內(nèi)發(fā)育分化成免疫系統(tǒng)，常見的受體鼠有NOD-scid Il2rγ-/-(NSG)小鼠及BALB/c背景的Rag2-/-Il2rγ-/-小鼠。同樣，外源肝細胞或是胚胎干細胞也可以在某些特殊的受體小鼠體

2、內(nèi)擴增成為肝臟嵌合小鼠，比如尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑轉(zhuǎn)基因小鼠模型(uPA模型)及延胡索酰乙酰乙酸脫氫酶缺陷小鼠模型(FAH模型)。然而，上述兩種模型都不是研究免疫系統(tǒng)與病原體感染組織相互作用的最佳模型。
　　人體生物學(xué)的研究受限于倫理因素及技術(shù)難度，人源化小鼠的發(fā)展卻為其提供了便利。免疫系統(tǒng)人源化(HIS)小鼠在研究人類免疫反應(yīng)及嗜人免疫系統(tǒng)病原菌感染方面表現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景;而肝臟人源化小鼠也在人類嗜肝病原菌感染研究和抗

3、肝炎病毒藥物的臨床評判方面發(fā)揮了重要的作用。但是，進一步研究某些特殊疾?。ㄈ鏗BV, HCV感染引發(fā)的肝炎以及瘧疾的肝臟階段）的病理發(fā)生，免疫關(guān)系，以及發(fā)病機制需要一種更好的小鼠模型，即免疫系統(tǒng)和病原體靶向組織同時實現(xiàn)人源化，并能通過MHC分子相互識別。最近，研究者們建立了AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型，他們從15-18周的胎肝組織中分離得到肝臟祖細胞，并跟CD34+人造血干細胞一起轉(zhuǎn)輸給BALB/c背景的Rag2-/-1l2r

4、γ-/-小鼠，從而成功建立了免疫系統(tǒng)和肝臟同時人源化的小鼠模型。盡管該模型能較好滿足研究的需要，但是胎肝組織的獲取難度限制了該模型的廣泛應(yīng)用。
　　近年來，也有報道稱通過骨髓轉(zhuǎn)輸?shù)姆椒?，造血干細胞能在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成肝細胞。在本論文中，我們用延胡索酰乙酰乙酸脫氫酶缺陷的小鼠進行骨髓重建，以探求造血干細胞能否在受體小鼠體內(nèi)同時發(fā)育成免疫系統(tǒng)和肝臟細胞。該模型的成功建立將極大地促進疾病狀態(tài)下免疫系統(tǒng)與肝細胞的相互作用的研究。
　　本研

5、究中，我們首先通過體重監(jiān)測，血清ALT檢測，以及肝損傷的觀測等手段觀察了FAH缺陷鼠在NTBC停藥后的生長情況;接著，我們將小鼠肝細胞或人源肝細胞系轉(zhuǎn)入FAH缺陷鼠體內(nèi)，觀察外源肝細胞能否成功植入受體鼠肝臟并實現(xiàn)擴增;然后，我們嘗試運用同基因，異基因，甚至異種骨髓移植的方法在FAH缺陷鼠體內(nèi)實現(xiàn)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建。在轉(zhuǎn)輸骨髓后，給受體鼠停止NTBC用藥，并觀察其體重及血清ALT變化。為評判免疫系統(tǒng)的重建，我們每兩周檢測一次外周血。重

6、建8周后，我們分離檢測嵌合鼠的骨髓，胸腺，外周血，肝臟以及淋巴結(jié)中供體淋巴細胞分布情況，并用組織學(xué)染色的方法分析小鼠脾臟和淋巴結(jié)中的免疫重建狀況。與此同時，我們給嵌合鼠免疫HBV疫苗或是OVA蛋白，然后用RIA或ELISA的方法檢測小鼠血清中特異抗體的產(chǎn)生情況。為評價肝細胞的重建，我們分離停藥后長期存活鼠的肝細胞并用流式分析表型。同時，我們也用H&E染色及免疫組化來分析肝組織切片。通過上述實驗，我們?nèi)〉昧艘韵乱恍┲饕Y(jié)果:
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7、.FAH小鼠在NTBC停藥后自發(fā)肝損傷首先，我們對比了FAH缺陷鼠在NTBC停藥與不停藥時的生長情況。我們發(fā)現(xiàn)，停藥后缺陷鼠的體重逐漸下降，當體重損失達到30％時，小鼠就會死亡。血清ALT也在逐周增加提示肝損傷在逐漸加重。分離停藥鼠的肝細胞體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)停藥后肝細胞更易凋亡。肝臟組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)淋巴細胞浸潤到肝臟局部，進一步研究發(fā)現(xiàn)，T,B淋巴細胞都可能參與了停藥后小鼠肝損傷的過程?？傊?，上述結(jié)果表明，NTBC能夠保護FAH缺陷鼠免于

8、肝損傷，NTBC的撤除可作為啟動FAH缺陷鼠肝細胞壞死的開關(guān)。
　　2.外源肝細胞向FAH移植后的體內(nèi)擴增接著，我們將新鮮分離的EGFP-Tg鼠的肝細胞轉(zhuǎn)入FAH缺陷鼠體內(nèi)，然后給小鼠停藥。與不轉(zhuǎn)輸?shù)耐Ｋ帉φ战M相比，轉(zhuǎn)輸組小鼠的體重及血清ALT水平能較快的恢復(fù)到正常水平，并且轉(zhuǎn)輸組小鼠的存活時間大大延長。同時，我們在轉(zhuǎn)輸鼠的肝臟內(nèi)檢測到EGFP陽性的供體肝細胞，它們能提供FAH來恢復(fù)受體鼠的肝臟功能。但是，當我們用人源肝細胞系LO

9、2細胞進行轉(zhuǎn)輸時，受體小鼠會發(fā)生肝臟腫瘤而死亡。我們在小鼠的肝臟中觀察到許多腫瘤結(jié)節(jié)，可能是LO2細胞系在體內(nèi)擴增太快導(dǎo)致的。
　　3.同基因骨髓移植后FAH小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建接下來，我們將同基因型的骨髓細胞轉(zhuǎn)入到FAH小鼠體內(nèi)觀察重建情況。我們選取了兩種供體小鼠，分別是EGFP-Tg小鼠和HBs-Tg小鼠。我們在轉(zhuǎn)輸28天后給小鼠停藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大部分骨髓轉(zhuǎn)輸小鼠在停藥后能存活至少5個月以上。骨髓轉(zhuǎn)輸小鼠表現(xiàn)出穩(wěn)定

10、的造血重建能力，髓系及淋巴系的造血發(fā)育都和正常供體鼠一樣。嵌合鼠外周血中NK，B，CD4T, CD8T細胞的數(shù)量也能逐漸發(fā)育正常，8周后受體鼠各臟器中免疫細胞就能重建完全，脾臟及淋巴結(jié)的組織學(xué)染色也進一步證明免疫重建的成功。為檢測重建免疫系統(tǒng)的功能，我們用HBV疫苗免疫小鼠2次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有嵌合鼠都能產(chǎn)生跟供體鼠相類似的HBV特異性的抗體。我們用停藥后長期存活的嵌合小鼠來評判肝細胞重建狀況。肝組織染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)供體來源的肝細胞成簇存在，

11、進一步用流式分析肝細胞的表型發(fā)現(xiàn)髓樣單個核細胞(CD45+F4/80+Gr-1+CD11b+CD11c-)可能是體內(nèi)骨髓來源肝細胞的前體。綜上結(jié)果可知，同基因型小鼠來源的造血干細胞是能夠在FAH缺陷鼠體內(nèi)同時重建免疫系統(tǒng)及肝臟系統(tǒng)的。
　　4.異基因骨髓移植后FAH小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建確定同基因型的骨髓能在FAH缺陷鼠體內(nèi)成功實現(xiàn)免疫系統(tǒng)及肝細胞的雙重建之后，我們又進行了異基因型的骨髓移植。我們同樣選取了兩種供體小鼠，分

12、別是C3H/HeJ小鼠(H-2k) and HBV-Tg小鼠(H-2d)。大約60％的異基因骨髓移植小鼠能在停藥后存活5個月以上。通過檢測嵌合鼠外周血單個核細胞的比例，我們發(fā)現(xiàn)NK，B，CD4T, CD8T淋巴細胞能逐漸發(fā)育正常，脾臟及淋巴結(jié)的組織學(xué)染色也進一步證明免疫系統(tǒng)重建成功。跟供體鼠相似，嵌合鼠在OVA蛋白免疫后能產(chǎn)生OVA特異性的抗體。同時，從嵌合鼠中分離出的肝細胞部分表達供體鼠MHC-Ⅰ類分子，并且這種肝細胞也表達受體鼠的M

13、HC-Ⅰ分子及CD45抗原，提示骨髓來源的肝細胞可能與受體原有的肝細胞發(fā)生了細胞融合。
　　5.異種骨髓移植后FAH小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建接下來，我們想探明異種骨髓細胞能否在FAH缺陷鼠體內(nèi)實現(xiàn)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建。我們將S.D.大鼠(RT1A，F(xiàn)ah+/+)的骨髓細胞轉(zhuǎn)入FAH缺陷鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有50％的嵌合鼠停藥后能存活5個月以上，血清轉(zhuǎn)氨酶也維持在正常水平。嵌合小鼠表現(xiàn)出穩(wěn)定的造血重建能力，髓系及淋巴系的造血發(fā)

14、育也很正常，外周血中供體來源的單個核細胞（RT1A+）比例接近100％。嵌合鼠外周血中NK，B，CD4T, CD8T淋巴細胞逐漸發(fā)育正常，8周后受體鼠各臟器中T細胞比例接近于供體大鼠。與此同時，從嵌合鼠中分離出的肝細胞部分表達大鼠RT1A分子，肝臟組織學(xué)分析也顯示FAH陽性肝細胞成團分布。總之，異種來源的造血干細胞同樣能在FAH缺陷鼠體內(nèi)完成雙重建。
　　6.人源造血干細胞轉(zhuǎn)輸后FAH-rag2雙缺陷小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建

15、基于之前同基因，異基因，異種骨髓轉(zhuǎn)輸所取得的結(jié)果，我們將純化的人臍血干細胞轉(zhuǎn)入FAH-rag2雙缺陷小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，停藥后轉(zhuǎn)輸鼠體重先是由于亞致死照射下降10％左右，然后迅速恢復(fù)正常并穩(wěn)步上升。血清ALT也一直維持在較低水平，暗示著人源造血干細胞的移植部分恢復(fù)了嵌合鼠體內(nèi)的肝臟功能。同時我們注意到，與非轉(zhuǎn)輸對照鼠相比，大多數(shù)嵌合鼠的存活時間更長。另外，嵌合鼠的肝臟功能恢復(fù)與人造血干細胞的植入程度有關(guān)，比較不同的受體小鼠，我們發(fā)現(xiàn)FR

16、G受體鼠在接受轉(zhuǎn)輸后存活時間長于FAH單缺陷鼠。我們也確實在FRG受體鼠體內(nèi)檢測到更多的人源細胞。肝臟H&E染色能檢測到人源肝細胞，它的細胞更大，嗜酸性染色較淺。由于B6背景的小鼠HSC植入較少，我們在肝組織中只檢測到少量FAH陽性的人源肝細胞?？傊?，人源HSC轉(zhuǎn)輸后，受體鼠肝臟內(nèi)確實有部分肝細胞被人源肝細胞取代，它們產(chǎn)生FAH來減輕肝損傷。
　　小結(jié):本研究主要發(fā)現(xiàn)來自一個個體的造血干細胞能在免疫缺陷或是照射過的FAH缺陷鼠體內(nèi)

17、成功發(fā)育分化成免疫細胞和肝細胞。我們第一次比較系統(tǒng)地逐步通過同基因，異基因，異種骨髓移植，證明了單種造血干細胞可以在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)免疫系統(tǒng)及肝細胞的雙重建。同時，我們也發(fā)現(xiàn)給FAH-rag2雙缺陷小鼠轉(zhuǎn)輸人源造血干細胞能部分恢復(fù)受體小鼠的肝臟功能。上述結(jié)果提示，將來運用更加適合人源化構(gòu)建的免疫缺陷型FAH小鼠，如Fah-/-NSG小鼠，有可能構(gòu)建出一種更理想的人源化小鼠，這種小鼠具備免疫系統(tǒng)及肝細胞的雙重人源化，并具備HLA分子識別的一致