基于肝損傷小鼠模型重構(gòu)小鼠和人的肝臟.pdf

1、目前，肝病相關(guān)的體內(nèi)研究多基于在小鼠的肝臟開展。然而，小鼠肝臟與人的存在差異，致使基于小鼠肝臟獲得的許多研究結(jié)果不能直接應用到人體，而人的體內(nèi)研究受倫理和技術(shù)等方面的制約。肝臟人源化的嵌合體（人鼠嵌合肝）小鼠是在人肝臟發(fā)育和再生機制、人類肝臟相關(guān)疾?。ǜ窝住⒏斡不透伟┑龋┌l(fā)病機制、肝炎病毒(HBV和HCV等)易感動物模型建立、藥物代謝動力學等領(lǐng)域具有重要的應用價值，其也為在大動物（如小型豬）體內(nèi)重構(gòu)人肝臟提供理論依據(jù)和進行實踐探索，并

2、成為臨床前研究由鼠到人之間的重要載體和橋梁。因此，制備高比率嵌合有人肝細胞的人-鼠嵌合肝對人類的肝病研究具有巨大而深遠的意義。
　　 早期是將人肝細胞異位移植進小鼠體內(nèi)建立人鼠嵌合肝，現(xiàn)在隨著科學技術(shù)的不斷進步，人們開始將目光轉(zhuǎn)向利用干細胞來實現(xiàn)人和鼠肝臟的嵌合。干細胞(stem cells，SC)是一類具有自我復制能力(self-renewing)的多潛能細胞，它是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛

3、在功能，醫(yī)學界稱為“萬用細胞”。這就為干細胞在一定環(huán)境下發(fā)育成肝細胞提供了理論依據(jù)。同時也為在小鼠體內(nèi)建立人鼠嵌合肝模型提供了可能。
　　 截止到現(xiàn)在，國內(nèi)外均有文獻報道將干細胞通過核移植或?qū)m內(nèi)移植進正常動物體內(nèi)，以實現(xiàn)多組織多器官的嵌合。但是，由于宿主體內(nèi)的微環(huán)境中缺乏移植細胞生長的各種激素和生長因子，宿主細胞的增殖將優(yōu)先于移植細胞，因此，各組織器官的嵌合率比較低。為了克服上述困難，得到高比率嵌合的個體，選用特定器官缺陷的動物

4、模型作為受體環(huán)境是較為理想的選擇。
　　 富馬酰乙酰乙酸鹽水解酶(Fah)基因敲除小鼠缺乏Fah基因，酪氨酸分解代謝的最后一步受到阻礙，導致富馬酰乙酰乙酸鹽(FAA)和前體(MAA)底物的聚集，F(xiàn)AA與MAA對肝臟有毒性。利用此肝損傷小鼠模型作為受體動物，將人干細胞移植進該鼠的囊胚中，有望提高人干細胞在宿主體內(nèi)的增殖優(yōu)勢，這對研發(fā)人肝細胞高比率嵌合的嵌合肝模型是至關(guān)重要的。
　　 為實現(xiàn)靈敏的非損傷、實時和可視化體內(nèi)示蹤

5、移植供體細胞及其在體內(nèi)衍生的細胞，通過綜合分析活體內(nèi)生物發(fā)光[用熒光素酶(Luciferase，Luc)基因標記細胞等]成像和熒光[熒光報告基團（GFP和RFP等）]成像各自的特點和優(yōu)勢，為將生物發(fā)光成像和熒光成像的優(yōu)點集為一身，我們將用雙報告或三熒光報告基因標記供體移植細胞，已達到活體示蹤的目的。
　　 在研究中，我們首先利用小鼠誘導性多潛能干細胞(Mouse inducedpluripotent stem cells，miP

6、SCs)通過囊胚腔移植(Blastocyst transplantation)建立鼠/鼠嵌合肝動物模型，待方法和技術(shù)成熟后再利用人骨髓間充質(zhì)干細胞(Humanbone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)通過囊胚腔移植建立人/小鼠嵌合肝動物模型。
　　 第一部分小鼠誘導性多潛能干細胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝動物模型
　　 目的:
　　 通過小鼠誘導性多潛能干細

7、胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝動物模型，一方面可以觀察干細胞在體內(nèi)對受損肝臟的修復作用，另一方面為建立人/鼠嵌合肝模型提供理論和實踐基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:
　　 (1)慢病毒載體pEF1 a-ZsGreen-Fluc鑒定，慢病毒生產(chǎn)與鑒定，慢病毒感染miPSCs;(2)檢測病毒感染后的miPSCs(LG-miPSCs)是否仍然保持其干性;(3)鼠/鼠嵌合體動物的制作將攜帶有綠色熒光蛋白(ZsGreen)

8、和熒光素酶(Fluc)雙報告基因的miPSCs移植進Fah(-/-)小鼠的囊胚中，然后將囊胚移植進假孕母鼠的子宮內(nèi)，待其出生;(4)體式熒光顯微鏡檢測待小鼠出生后3天在鏡下觀察是否可以看到綠色熒光，待小鼠成年后取材，取其肝臟、腎臟、心臟、腦、肺臟、脾臟等臟器在鏡下觀察是否可見綠色熒光;(5)小動物活體成像儀檢測小鼠從出生到成年，不同時間點腹腔注射Fluc底物，觀察是否可見Fluc熒光;(6)PCR檢測取成年后小鼠的肝臟、鼠尾、肺、腦、腎

9、臟、心臟、脾臟、腸等組織，一部分用于提取基因組DNA[另一部分用于制備石蠟切片以用于HE染色和免疫熒光(Immunofluorescence)檢測]，并采用Fah引物PCR檢測各器官中是否有移植細胞的嵌合;(7) HE染色觀察嵌合體動物肝臟的組織結(jié)構(gòu)以確定肝臟結(jié)構(gòu)是否正常;(8)免疫熒光檢測檢測嵌合體小鼠肝臟中Fah基因的表達水平，及其白蛋白(Alb)、CK18、CK19、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)的表達;(9) Western

10、blot檢測嵌合體小鼠肝臟中Fah基因表達。
　　 結(jié)果:
　　 (1)慢病毒載體鑒定、感染miPSCs以及其干性的鑒定鑒定結(jié)果符合預期，感染miPSCs(LG-miPSCs)效率接近100％，LG-miPSCs仍保持其多向分化潛能;
　　 (2)妊娠結(jié)局先后將LG-miPSCs移植進160枚Fah(-/-)小鼠的囊胚中，接著種植到10只假孕母鼠的子宮內(nèi)，有四窩仔鼠順利出生，數(shù)量共38只，經(jīng)過撤藥處理后，最終有2

11、只幸存鼠發(fā)育到成年;
　　 (3)體視熒光顯微鏡和小動物活體成像儀檢測從出生到取材各個時間點均未檢測到ZsGreen和Fluc雙報告基因的表達;
　　 (4) Fah或Lue基因的基因型鑒定采用PCR對潛在的嵌合鼠所取肝臟組織針對FAH或Luc基因行基因型鑒定，在嵌合肝中檢測到野生型Fah基因和報告基因Fluc的存在;
　　 (5)HE染色嵌合鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)與正常小鼠的結(jié)構(gòu)基本一致，而撤藥的和沒撤藥的Fah(-/

12、-)小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂無序;
　　 (6)免疫熒光檢測嵌合體小鼠肝臟免疫熒光檢測結(jié)果顯示，大部分肝細胞表達Fah，兩只嵌合體小鼠的嵌合肝中LG-miPSCs衍生的鼠肝細胞的嵌合率分別為84.69％和88.43％，同時Fah陽性的肝細胞（即LG-miPSCs衍生的鼠肝細胞）能夠正常表達Alb、CK18、CK19和teansferrin;
　　 (7)Western blot檢測Fah基因表達兩只嵌合體小鼠的嵌合肝均能正常

13、表達Fah基因，而Fah(-/-)小鼠未檢測到Fah基因表達。
　　 結(jié)論:
　　 (1)成功獲得LG-miPSCs衍生的鼠肝細胞高比率嵌合的鼠-鼠嵌合肝小鼠模型，這為進一步利用hMSCs通過囊胚腔移植建立人/小鼠嵌合肝動物模型奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 第二部分人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)囊胚腔移植建立人/鼠嵌合肝動物模型的前期工作
　　 目的:
　　 通過人骨髓間充質(zhì)細胞(hMSCs)囊胚腔移

14、植在小鼠受損肝臟上建立人/鼠嵌合肝動物模型，該模型一方面將為在生物活體內(nèi)研究人干細胞生物學行為提供理想模型，另一方面也將為在體內(nèi)研究人類肝臟發(fā)育和再生、肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展和治療以及藥物代謝評價提供理想模型。
　　 材料和方法:
　　 (1)慢病毒載體pCMV-RFP-Alb-fLuc-ZsGreen(簡稱為pCRAGL)鑒定，慢病毒生產(chǎn)與鑒定，慢病毒感染hMSCs;
　　 (2)病毒感染后hMSCs干性的鑒定;<