HCV小鼠模型的建立及其在肝臟免疫損傷研究中的應(yīng)用.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis CVirus，HCV)是黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒，是慢性肝炎的主要致病因子之一。臨床資料顯示，丙肝患者的肝細(xì)胞極易發(fā)生損傷，且肝細(xì)胞的自身修復(fù)能力減弱、增生異常，最終引發(fā)肝纖維化、肝硬化及肝癌的發(fā)生，迄今仍缺乏有效的防治手段。加強(qiáng)丙型病毒性肝炎的相關(guān)基礎(chǔ)研究，是當(dāng)前丙型病毒性肝炎防治研究中的重要命題。
　　HCV是一種非細(xì)胞毒性的嗜肝病毒，丙肝患者肝細(xì)胞極易發(fā)生損傷的現(xiàn)象主要是由宿主免疫系統(tǒng)與

2、受病毒感染的肝細(xì)胞間的相互作用引起。特別是宿主肝臟免疫系統(tǒng)對(duì)被感染肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的異常免疫反應(yīng)導(dǎo)致了肝細(xì)胞損傷與修復(fù)的平衡失調(diào)。但HCV和宿主肝臟免疫系統(tǒng)間相互作用的機(jī)制尚不明確，探索HCV和宿主肝臟免疫系統(tǒng)之間的相互作用是本研究的重要目的。
　　本研究分以下兩個(gè)部分展開(kāi):
　　1.肝臟特異性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)的探索與應(yīng)用
　　合適的動(dòng)物模型是探索HCV免疫致病機(jī)理的重要環(huán)節(jié)。目前，可感染HCV的動(dòng)物模型僅限于黑猩猩、嵌合人類肝

3、細(xì)胞小鼠模型及多種HCV受體聯(lián)合轉(zhuǎn)基因小鼠模型。但由于受數(shù)量有限、價(jià)格昂貴等因素的影響，限制了這幾類動(dòng)物模型在基礎(chǔ)研究中的廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型為研究HCV蛋白與宿主之間的相互作用奠定了良好的基礎(chǔ)，但由于存在先天免疫耐受，使其不能應(yīng)用于HCV和肝臟免疫系統(tǒng)間的相互作用研究?；诖?，采用合適的方法建立免疫功能正常并適于實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用的HCV動(dòng)物模型是目前抗HCV相關(guān)研究的重要環(huán)節(jié)。
　　1.1眼底靜脈叢水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)的

4、建立
　　基于經(jīng)典的水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)和眼底靜脈叢注射技術(shù)建立的眼底靜脈叢水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)具有良好的肝臟靶向性，在目前缺乏合適的HCV小動(dòng)物模型的前提下，通過(guò)該方法建立HCV小鼠模型替代HCV體內(nèi)感染模型可能是一種快速、高效、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便的構(gòu)建HCV肝臟特異性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的新方法。傳統(tǒng)的水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)有其自身難以克服的缺點(diǎn)，因此，本研究結(jié)合眼底靜脈叢輸注建立了眼底靜脈叢水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)。該技術(shù)是將大量含有目的基因表達(dá)質(zhì)粒的鹽水溶液從眼底靜

5、脈快速注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)外源基因在肝臟特異、高效表達(dá)。通過(guò)條件摸索，確立了應(yīng)用該技術(shù)的最適轉(zhuǎn)染條件，并分析了其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物器官機(jī)能的影響。在轉(zhuǎn)染效率方面，眼底靜脈叢水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)與經(jīng)典的尾靜脈水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)相當(dāng)。該技術(shù)操作更簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)。最為關(guān)鍵的是，眼底靜脈叢水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)克服了尾靜脈水動(dòng)力轉(zhuǎn)染僅能用于尾靜脈適合注射的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)用限制。該技術(shù)除可用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外，還可用于尾靜脈無(wú)法注射或無(wú)尾靜脈的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，有效拓展了水動(dòng)力轉(zhuǎn)

6、染技術(shù)的應(yīng)用范圍。
　　1.2密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶介導(dǎo)外源基因在小鼠肝臟長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)
　　噬菌體整合酶技術(shù)是一種可以介導(dǎo)外源基因在靶細(xì)胞發(fā)生特異性整合的生物酶技術(shù)。新近報(bào)道的鼠密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶針對(duì)鼠類基因特點(diǎn)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，對(duì)于鼠源細(xì)胞具有更高的整合效率。
　　為促進(jìn)水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入肝組織中的外源基因在小鼠肝細(xì)胞中長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中引入鼠密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶技術(shù)。并以NF-κB sensor質(zhì)

7、粒作為報(bào)告基因，通過(guò)與噬菌體整合酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)對(duì)活體小鼠肝臟長(zhǎng)期穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的技術(shù)優(yōu)化，建立了可長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)肝臟NF-κB活性的小動(dòng)物模型。研究結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的噬菌體整合酶系統(tǒng)相比，鼠密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶可以更加有效的促使外源基因在活體小鼠肝細(xì)胞中發(fā)生整合，并介導(dǎo)外源基因長(zhǎng)期高效表達(dá)。
　　1.3基于水動(dòng)力轉(zhuǎn)染和整合酶技術(shù)建立HCV基因組肝臟長(zhǎng)期表達(dá)小鼠模型
　　在前期研究工作基礎(chǔ)上，我們聯(lián)合水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)和鼠密碼子優(yōu)化

8、的噬菌體整合酶技術(shù)，基于免疫功能正常的C57BL/6小鼠，建立了HCV全基因組肝臟長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的動(dòng)物模型。此外，在HCV全基因組表達(dá)載體上融合了報(bào)告基因一螢火蟲(chóng)熒光素酶，HCV在小鼠肝臟的表達(dá)情況可以通過(guò)活體成像技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了方便。
　　2.HCV促進(jìn)小鼠肝臟免疫損傷的機(jī)制研究
　　強(qiáng)勢(shì)的肝臟免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御外來(lái)侵襲的重要防御機(jī)制。占肝臟淋巴細(xì)胞總數(shù)30％左右的NK細(xì)胞，對(duì)抵抗病毒、寄生菌感染和惡性轉(zhuǎn)化

9、細(xì)胞侵潤(rùn)等侵害具有十分重要的意義。但NK細(xì)胞是否參與丙肝患者肝細(xì)胞損傷的免疫過(guò)程尚不明確。因此本研究尋找以NK細(xì)胞為代表的肝臟免疫細(xì)胞在丙肝患者肝細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制，可能是防治HCV所導(dǎo)致的肝臟疾病的重要方法。
　　2.1 HCV對(duì)小鼠肝臟免疫細(xì)胞的影響
　　以本研究建立的免疫功能正常的HCV全基因組肝臟長(zhǎng)期表達(dá)小鼠模型為基礎(chǔ)，首先分析HCV表達(dá)對(duì)肝臟免疫細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示:HCV降低了小鼠肝臟NK細(xì)胞的數(shù)量，但不影響其

10、活性; HCV對(duì)小鼠其他類型的肝臟淋巴細(xì)胞（NKT、T、DC等）未造成顯著影響。這一結(jié)果與臨床報(bào)道相似。
　　2.2 HCV促進(jìn)Con A誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷及其免疫學(xué)機(jī)制
　　鑒于NK細(xì)胞在肝臟天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮的重要作用，我們認(rèn)為，肝臟NK細(xì)胞的減少可能會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)產(chǎn)生一定的影響。為進(jìn)一步探索HCV與宿主肝臟免疫系統(tǒng)的關(guān)系，基于該HCV小鼠模型，并結(jié)合Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷模型，對(duì)HCV免疫致病機(jī)理進(jìn)行探索

11、。結(jié)果顯示:中等劑量Con A刺激后，HCV組小鼠的肝臟免疫損傷現(xiàn)象增強(qiáng);而高劑量Con A刺激后，HCV小鼠發(fā)生嚴(yán)重的自身免疫性肝炎并促使小鼠死亡率增高。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示:ConA靜脈注射誘發(fā)小鼠自身免疫性肝炎后，小鼠肝臟免疫細(xì)胞活化，其中肝臟天然免疫細(xì)胞---NK細(xì)胞的數(shù)量和功能在HCV組和對(duì)照組小鼠間的差異最為明顯。選擇性清除小鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞，則HCV小鼠對(duì)Con A誘導(dǎo)的肝損傷的敏感性降低，肝損傷減輕。說(shuō)明HCV小鼠對(duì)Con

12、 A誘導(dǎo)的肝損傷的敏感性增強(qiáng)與小鼠肝臟NK細(xì)胞的過(guò)度活化相關(guān)。針對(duì)NK細(xì)胞功能的研究結(jié)果顯示，肝臟NK細(xì)胞免疫功能過(guò)度激活依賴于NK細(xì)胞表面激活性受體NKG2D及其胞內(nèi)與其免疫活性密切相關(guān)的細(xì)胞因子（IFN-γ、 TNF-α等）的表達(dá)。同時(shí)，NKG2D在肝細(xì)胞表面的配體NKG2DL(H60)的表達(dá)水平也顯著上調(diào)。
　　綜上所述，本研究結(jié)合眼底靜脈叢水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)、密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶和活體熒光成像技術(shù)，基于免疫功能正常的C57

13、BL/6小鼠，建立了可視化的HCV肝臟特異性長(zhǎng)期表達(dá)小鼠模型。研究顯示，該模型對(duì)Con A誘導(dǎo)的肝損傷更加敏感，而這一現(xiàn)象與肝臟NK細(xì)胞的異?；罨嚓P(guān)，肝臟NK細(xì)胞發(fā)揮病理性免疫損傷作用主要是通過(guò)NKG2D/NKG2DL(H60)相關(guān)信號(hào)通路及其胞內(nèi)與其免疫活性相關(guān)的細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α等）的表達(dá)。本研究從肝臟天然免疫系統(tǒng)角度部分解釋了HCV和肝臟免疫細(xì)胞間的相互關(guān)系，對(duì)HCV急慢性感染的防控及HCV導(dǎo)致的肝臟疾病的治療具有