多芳環(huán)化合物降解菌的篩選、特性及降解途徑研究.pdf

1、多芳環(huán)類化合物是化學(xué)合成工業(yè)中的一大類重要原料，種類繁多，廣泛應(yīng)用于制藥、化工和印染等行業(yè)，易造成水體、土壤等環(huán)境污染。丙酯草醚，[4-（2-（4，6-二甲氧基-2-嘧啶氧基）芐胺基]苯甲酸正丙酯]，是我國(guó)具自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型高效除草劑，丙酯草醚原藥、油力（10％乳油制劑）和油力Ⅱ(10％懸浮劑)已獲農(nóng)藥臨時(shí)登記證和農(nóng)藥生產(chǎn)批準(zhǔn)證書(shū)。然而，關(guān)于丙酯草醚的微生物降解特性和生物降解途徑及其降解蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)研究迄今未見(jiàn)報(bào)道，關(guān)于同時(shí)降解萘

2、和丙酯草醚的基因工程菌也未見(jiàn)報(bào)道。本研究綜合運(yùn)用傳統(tǒng)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、核素示蹤技術(shù)、現(xiàn)代生物技術(shù)和現(xiàn)代儀器分析技術(shù)，分別從化工園區(qū)污水處理廠活性污泥和常州市南郊施用過(guò)丙酯草醚的農(nóng)田土壤中篩選、純化獲得丙酯草醚高效降解菌株Amycolatopsissp.M3-1和萘高效降解菌株P(guān)seudomonadaceae sp.Nai8，系統(tǒng)研究丙酯草醚和萘的微生物降解特性，以[B環(huán)-4，6-14C]標(biāo)記丙酯草醚和[C環(huán)-U-14C]標(biāo)記丙酯草醚為示

3、蹤劑，研究丙酯草醚在水體和土壤中的生物降解途徑，利用雙向電泳技術(shù)初步鑒定了菌株M3-1降解丙酯草醚的降解功能酶，并利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，構(gòu)建可同時(shí)降解丙酯草醚和萘的高效工程菌MN6。微生物降解丙酯革醚的特性及降解途徑、代謝機(jī)制等進(jìn)行系統(tǒng)的研究，有助于深入了解丙酯草醚在環(huán)境的行為，為合理、安全使用丙酯草醚和環(huán)境生物修復(fù)提供技術(shù)支持和理論指導(dǎo)，保證環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的安全性。
　　 本研究的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.從自然界中

4、富集、篩選出5株以萘為唯一碳源和15株以丙酯草醚作為唯一碳源生長(zhǎng)的降解菌。對(duì)降解效果較好的菌株Nai8、M3-1和CY進(jìn)行進(jìn)一步研究，經(jīng)生理生化和16S rDNA鑒定，菌株Nai8為Pseudomonadaceae sp.Nai8，M3-1為較罕見(jiàn)的地中海擬無(wú)枝酸菌Amycolatopsis sp.M3-1，CY為Bacillus sp.CY。菌株M3-1降解丙酯草醚的最適條件為35℃、pH6.0、接種量8％，底物濃度為100mg/L，

5、培養(yǎng)25天，丙酯草醚降解率達(dá)63.30％。當(dāng)丙酯草醚濃度高于300mg/L時(shí)，對(duì)菌株M3-1的降解效果有較強(qiáng)的抑制作用，并隨著底物丙酯草醚濃度的增加而增強(qiáng)，而濃度較低時(shí)(＜150ppm)降解效果較好，較高濃度的丙酯草醚可以抑制菌株M3-1的生長(zhǎng)繁殖速度，大大降低細(xì)胞內(nèi)降解酶的生物合成速度，甚至抑制酶的合成。菌株Nai8降解萘的最適條件為30℃，pH7.0，接種量8％，培養(yǎng)100h，降解率達(dá)96.24％。
　　 2.以B-14C-

6、ZJ0273和C-14C-ZJ0273為示蹤劑，研究水體中丙酯草醚在Amycolatopsis sp.M3-1的催化下的代謝規(guī)律，在培養(yǎng)體系中有6種中間代謝產(chǎn)物被檢測(cè)出有放射性活度，用LC-MS鑒定其結(jié)構(gòu)，并推導(dǎo)出ZJ0273在水溶液中的代謝途徑。首先其丙基酯鍵被水解形成M1—(4-(2-(4，6-二甲基-2-嘧啶氧基)芐胺基）苯甲酸;隨后，M1上的側(cè)鏈CH-NH鍵發(fā)生酰化反應(yīng)生成M2-（4-（2-（4，6-二甲基-2-嘧啶氧基）苯甲酰

7、氨基）苯甲酸;同時(shí)，M1通過(guò)水解CH-NH鍵生成M3—4，6-二甲基-2-嘧啶氧基苯甲酸，M2的CO-NH鍵也在Amycolatopsis sp.M3-1的催化下，發(fā)生水解反應(yīng)形成M3，M3也是丙酯草醚在雜草中最主要的代謝產(chǎn)物;M3結(jié)構(gòu)的醚鍵發(fā)生斷裂反應(yīng)生成M4-2-羥-4，6-二甲基-嘧啶和苯甲酸;M3嘧啶環(huán)上的甲氧基通過(guò)水解形成M5，即6-甲基-4-羥-2-嘧啶氧基苯甲酸，然后再通過(guò)進(jìn)一步的水解生成M6—尿嘧啶（2，4-羥基嘧啶）和

8、苯甲酸。在自然環(huán)境中（如土壤和淤泥中）M4、M6和苯甲酸均可以被其他微生物作為碳源和能源，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)與繁殖，并最終被降解成CO2和H2O。
　　 3.菌株M3-1對(duì)5種滅菌土壤紅砂田(S1)、黃松田(S2)、黃泥田(S3)、淡涂泥田(S4)和黃石土(S5)中的丙酯草醚均具有去除作用。培養(yǎng)90天后，S1、S4和S3中丙酯草醚的殘留量分別為48.60％、23.32％和5.31％。空白土樣中丙酯草醚殘留量均在緩慢的下降過(guò)程中，表

9、明丙酯草醚在土壤中的光解、水解及礦化等自然消解作用對(duì)丙酯草醚有一定的去除作用，但是去除效果不明顯。M3-1在5種未滅菌土壤中對(duì)丙酯草醚也具有很好的去除作用，培養(yǎng)90d，丙酯草醚在五種土壤中的殘留量分別為33.50％，31.14％，31.52％，22.03％和4.22％。
　　 4.運(yùn)用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)，丙酯草醚誘導(dǎo)菌株M3-1前后的蛋白變化進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，菌株M3-1經(jīng)過(guò)丙酯草醚誘導(dǎo)之后，胞內(nèi)蛋白圖譜發(fā)生較大的變化，

10、雙向電泳檢測(cè)出6個(gè)新蛋白點(diǎn)，5個(gè)表達(dá)量增加2倍以上的蛋白點(diǎn)（超過(guò)1倍上的蛋白質(zhì)點(diǎn)多達(dá)16個(gè)以上），通過(guò)MALDI-TOF-MS鑒定出8個(gè)蛋白質(zhì)，分別是Phosphoglycerate kinase、Citrate sysnthase、Lipase、Biotin carboxylase、aldehydrogenae、Small subunit aromaticoxygenase等與細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝相關(guān)的酶系。
　　 5.采用紫外誘變