多菌靈降解菌的降解特性及GFP標(biāo)記.pdf

1、多菌靈(MBC)，化學(xué)名稱為N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯，是一種高效廣譜低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，屬于苯胺類苯并咪唑衍生物，其使用范圍較廣，既可作為工業(yè)殺菌劑，又可作為一種有內(nèi)吸活性的植物殺菌劑，用于水果保鮮、蔬菜、果樹和谷類作物的病害防治。多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在土壤中降解半衰期較長(zhǎng)，能持久地殘留在使用部位，易致累積效應(yīng)，其在水體和土壤中的累積會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成威脅。有研究表明，微生物降解是沉積環(huán)境中多菌靈去除的主要途徑。因此尋

2、找并研究多菌靈降解菌是十分必要的。本文的主要研究?jī)?nèi)容有如下幾個(gè)方面： 1．該菌株NY97-1的16S rDNA經(jīng)同源序列比對(duì)，同源性為99％以上，結(jié)合生理生化指標(biāo)鑒定其屬于短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。 2．經(jīng)BamHI酶切的啟動(dòng)子探針載體pUC19-gfp與NY97-1基因組DNA的Sau3AI酶切片段酶連，酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a,建立B.p的啟動(dòng)子基因文庫(kù)。挑選其中的兩個(gè)強(qiáng)陽性克隆，亞克

3、隆來自短小芽孢桿菌總基因組的啟動(dòng)子活性片段F4、F5，構(gòu)建大腸桿菌一短小芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體pNW33N-GFP4、pNW33N-GFP5。通過電轉(zhuǎn)化得到gfg在B.p中的兩株標(biāo)記菌株。在熒光顯微鏡下，觀察到了明亮的綠色熒光，證明活性片段F4、F5均具有組成型啟動(dòng)子的功能，實(shí)現(xiàn)了GFP基因在B.p中組成型表達(dá)，且遺傳穩(wěn)定，為今后研究多菌靈降解菌B.p在自然環(huán)境中的定殖、分布及動(dòng)態(tài)變化打下了基礎(chǔ)。 3．本文研究并建立了多菌靈在降解

4、培養(yǎng)基中的殘留檢測(cè)方法。該方法采用甲醇和水溶液的混合液作提取劑，檢測(cè)結(jié)果表明：該方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度等指標(biāo)均符合農(nóng)藥殘留分析的基本要求，同以往所報(bào)道的方法相比具有樣品前處理過程相對(duì)簡(jiǎn)單，回收率高，重復(fù)性好，且費(fèi)用較低等特點(diǎn)，適合于該降解菌的降解能力的檢測(cè)。 4．本文對(duì)多菌靈降解菌株NY97-1 的降解性能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明∶該菌株對(duì)多菌靈有較強(qiáng)的降解能力。細(xì)菌菌株NY97-1 在多菌靈濃度為 100 mg·L<'-1>

5、的條件下，30℃振蕩培養(yǎng)24 h，多菌靈的降解率達(dá) 78.66％。外界條件對(duì)降解菌的降解也有顯著影響。培養(yǎng)基初始pH在6～10的范圍內(nèi)均可以高效降解多菌靈，pH為4時(shí)，對(duì)降解起較大的抑制作用。在多菌靈的濃度為 10～300 mg·L<'-1>時(shí)，菌株NY97-1 對(duì)多菌靈的降解率為42.44％～90.07％。在35～40℃時(shí)對(duì)農(nóng)藥降解率最高，經(jīng)高溫高壓處理后的菌液對(duì)多菌靈仍有降解作用，說明對(duì)降解起主要作用的物質(zhì)耐熱性好。共存底物有機(jī)氮可

6、以促進(jìn)菌株NY97-1 的降解能力，而無機(jī)氮源尿素對(duì)菌株NY97-1的降解能力起抑制作用。 5．實(shí)驗(yàn)證明菌株 NY97-1是一株多功能菌株，不僅具有降解多菌靈的功效，而且對(duì)多種枯萎菌具有拮抗效果。對(duì)番茄枯萎菌(Fusariumoxysporum (Schl.)f.sp．Lycopersici (Sacc.)Snyder et Hansen)、青椒枯萎菌(Fusarium oxysporum (Schl.) f.sp.vasinf

7、ectum (Snyd. et Hans))、西瓜枯萎菌 (Fusarium oxysporum f.sp. niveum (E.F.Smith) Snyder et Hansen)、仙客來枯萎菌(Fusarium sp)、一品紅枯萎菌(Fusarium sp)、黃瓜枯萎菌(Fusarium oxysporum (Schl．f.sp. cucumerinum Owen)的抑制率分別為50.8％，50.8％，54.1％，37.5％，31.

8、6％，42.5％。 6．多菌靈單劑對(duì)供試的六種枯萎菌菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制效果，但10％的NY97-1 活體菌液與多菌靈混配會(huì)降低多菌靈的毒力，表現(xiàn)為混配劑3d及7d 時(shí) EC<,50>均比多菌靈單劑的EC<,50>大。這表明NY97-1與多菌靈共存時(shí)主要表現(xiàn)其降解作用。該結(jié)果對(duì)指導(dǎo)NY97-1 的合理使用有重要意義。盡管其具有生防與降解雙重功效，但在實(shí)際應(yīng)用中仍以降解環(huán)境中殘留的多菌靈進(jìn)行生物修復(fù)為主。 7．研究了多菌

9、靈處理土壤的盆栽黃瓜子葉期及開花期不同器官中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、ATP酶活性的變化。結(jié)果表明多菌靈對(duì)花期不同器官中SOD、CAT、GPx、ATP酶活性所產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用顯著大于子葉期的。多菌靈對(duì)花期根莖葉及子葉期葉中SOD活性誘導(dǎo)作用明顯。多菌靈對(duì)花期根葉及子葉期葉中CAT有明顯的誘導(dǎo)作用，對(duì)花期莖及子葉期莖有明顯的抑制作用。而GPx花期及子葉期莖中有明顯的誘導(dǎo)作用。這說明隨著黃瓜