茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、茵陳蒿湯源于漢代張仲景所著的《傷寒論》，由茵陳、梔子、大黃組成，具有利膽退黃、抗肝損傷、防治脂肪肝、抗肝纖維化等作用，在肝病治療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。研究茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)開(kāi)發(fā)成分清楚、質(zhì)量可控、療效穩(wěn)定的創(chuàng)新中藥，從更深層次上挖掘這一經(jīng)典名方的現(xiàn)代臨床應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。
　　中藥復(fù)方所含成分眾多，但只有那些吸收進(jìn)入體內(nèi)的成分和/或其代謝產(chǎn)物（本課題組將其統(tǒng)稱為體內(nèi)“藥源性成分”）才有產(chǎn)生藥效的可能，且效應(yīng)成

2、分必須以血液為介質(zhì)輸送到靶器官或組織才能產(chǎn)生藥效。因此，有學(xué)者提出了基于“含藥血清”的中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究策略，該策略包括“血清藥理學(xué)”和“血清藥化學(xué)”研究。所謂“含藥血清”是指給動(dòng)物或人服用藥物后采集的血清或血漿;“血清藥理學(xué)”指采用體外細(xì)胞模型對(duì)含藥血清進(jìn)行藥效評(píng)價(jià);“血清藥化學(xué)”指采用現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)含藥血清中的藥源性成分進(jìn)行定性定量分析。對(duì)兩者研究結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析可以闡明中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　有鑒于此，本課題在

3、分別建立了茵陳蒿湯血清藥理學(xué)和血清藥化學(xué)研究方法的基礎(chǔ)上，以大鼠灌胃茵陳蒿湯全方后10個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的含藥血清和7個(gè)拆方配伍后固定時(shí)間點(diǎn)采集的含藥血清為研究對(duì)象，一方面測(cè)定了這17份含藥血清指紋圖譜及其中主要藥源性成分的含量，另一方面對(duì)這17份含藥血清進(jìn)行了保肝活性評(píng)價(jià)，最后分別采用藥時(shí)曲線和時(shí)效曲線比較及數(shù)據(jù)處理技術(shù)對(duì)血清藥化學(xué)和血清藥理學(xué)研究結(jié)果進(jìn)行了譜-效和量-效關(guān)系分析，初步闡明了茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　本論文

4、分文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究?jī)纱蟛糠帧?br>　　第一部分，文獻(xiàn)綜述。引用文獻(xiàn)213篇，分別對(duì)茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀、血清藥理學(xué)與血清藥化學(xué)相結(jié)合的中藥藥效物質(zhì)研究進(jìn)展進(jìn)行了文獻(xiàn)綜述，在此基礎(chǔ)上簡(jiǎn)要介紹了本課題的研究思路和方案設(shè)計(jì)。
　　第二部分，實(shí)驗(yàn)研究。包括以下3個(gè)方面:
　　一、茵陳蒿湯血清藥理學(xué)
　　1、茵陳蒿湯含藥血清制備方法研究
　　建立了CCl4誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷模型，以SD大鼠為

5、含藥血清供體，以含藥血清對(duì)損傷肝細(xì)胞增殖的影響為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選了含藥血清的制備方法。結(jié)果表明，每天以成人等效劑量的10倍茵陳蒿湯提取物間隔8h分兩次給正常大鼠灌胃給藥，連續(xù)3天，末次給藥后1h采集血漿比較合理，該條件下制備的茵陳蒿湯含藥血清對(duì)肝細(xì)胞損傷具有明顯保護(hù)作用。
　　2、H2O2誘導(dǎo)的HL-7702肝細(xì)胞損傷模型的建立
　　考察了造模時(shí)間及H2O2添加濃度對(duì)細(xì)胞增殖和AST泄漏的影響，建立了H2O2誘導(dǎo)的H

6、L-7702肝細(xì)胞損傷模型。結(jié)果表明，H2O2與正常肝細(xì)胞作用4h為適宜的造模時(shí)間，0.5mmol/L和2.5mmol/L H2O2分別為細(xì)胞增殖試驗(yàn)和AST泄漏檢測(cè)的適宜造模濃度。
　　3、體系中含藥血清添加量考察
　　分別將去蛋白處理的含藥血清以5％、10％、20％和40％的濃度加入培養(yǎng)體系，分別以細(xì)胞增殖和AST泄漏為指標(biāo)，考察了體系中含藥血清適宜的添加量。結(jié)果表明，體系中添加5％的含藥血清能明顯促進(jìn)損傷肝細(xì)胞增殖，減

7、少AST泄漏。
　　二、茵陳蒿湯血清藥化學(xué)研究
　　1、含藥血清HPLC-UV指紋圖譜研究
　　采用HPLC法測(cè)定了10批含藥血清指紋圖譜，建立了238nm和440nm下茵陳蒿湯含藥血清指紋圖譜共有模式，并與空白血清、體外指紋圖譜和對(duì)照品指紋圖譜色譜峰的保留時(shí)間、紫外吸收光譜圖比對(duì)，對(duì)含藥血清中的藥源性成分進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，兩個(gè)波長(zhǎng)下10批含藥血清指紋圖譜相似度良好。238nm下含藥血清指紋圖譜產(chǎn)生了9個(gè)藥源性成分

8、;440nm下產(chǎn)生了15個(gè)藥源性成分，其中4個(gè)為238nm下的共有成分。所有20個(gè)藥源性成分中，6個(gè)為體外原形成分，14個(gè)為體內(nèi)代謝產(chǎn)物。原形成分中3個(gè)分別被指認(rèn)為來(lái)源于梔子的環(huán)烯醚萜類成分京尼平苷酸和梔子苷以及來(lái)源于大黃的蒽醌類成分大黃酸，另外3個(gè)原形成分中的1個(gè)為來(lái)源于大黃的蒽醌類成分，2個(gè)為來(lái)源于梔子的西紅花酸類成分。14個(gè)體內(nèi)代謝產(chǎn)物中的1個(gè)為環(huán)烯醚萜類成分的代謝產(chǎn)物、4個(gè)為蒽醌類成分的代謝產(chǎn)物、9個(gè)為西紅花酸類成分的代謝產(chǎn)物。

9、
　　2、茵陳蒿湯含藥血清中京尼平苷酸、梔子苷、大黃酸含量測(cè)定
　　建立了HPLC法測(cè)定茵陳蒿湯含藥血清中京尼平苷酸、梔子苷和大黃酸3個(gè)藥源性成分含量的方法。結(jié)果表明，京尼平苷酸、梔子苷、大黃酸分別在0.0019～0.57μg（r=0.9998）、0.0018～0.54μg(r=0.9999)、0.0016～0.48μg(r=0.9999)范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。所建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于茵陳蒿湯含藥血清

10、中3個(gè)成分的含量測(cè)定。
　　三、茵陳蒿湯保肝作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的譜-效、量-效關(guān)系分析
　　1、不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清保肝作用的譜-效、量-效關(guān)系分析
　　采集了大鼠灌胃茵陳蒿湯全方后10個(gè)時(shí)間點(diǎn)含藥血清，采用已建立的方法測(cè)定了含藥血清指紋圖譜和含藥血清中京尼平苷酸、梔子苷、大黃酸3個(gè)成分的含量，并進(jìn)行了保肝活性評(píng)價(jià)，分別采用藥時(shí)曲線和時(shí)效曲線比較及數(shù)據(jù)處理技術(shù)進(jìn)行了含藥血清經(jīng)時(shí)譜-效和量-效關(guān)系分析。結(jié)果表明，茵陳蒿湯含藥

11、血清中與肝細(xì)胞損傷保護(hù)作用相關(guān)的成分包括來(lái)源于大黃的原形蒽醌類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物、來(lái)源于梔子的原形環(huán)烯醚萜類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物、來(lái)源于梔子的原形西紅花酸類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物，其中2個(gè)蒽醌類成分代謝產(chǎn)物、1個(gè)原形蒽醌類成分、1個(gè)西紅花酸類成分體內(nèi)代謝產(chǎn)物活性較強(qiáng)。研究結(jié)果同時(shí)提示，含藥血清所含蒽醌類成分大黃酸及環(huán)烯醚萜類成分梔子苷、京尼平苷酸等可能具有肝細(xì)胞保護(hù)和損傷雙向作用，即低劑量保護(hù)高劑量則產(chǎn)生毒性。
　　2、拆方配方含

12、藥血清保肝作用的譜-效、量-效關(guān)系分析
　　采集了大鼠灌胃茵陳蒿湯7個(gè)拆方配伍后1h含藥血清，采用與全方不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清相同的方法進(jìn)行了指紋圖譜和含量測(cè)定及保肝活性評(píng)價(jià)，并運(yùn)用數(shù)據(jù)處理技術(shù)進(jìn)行了譜-效和量-效關(guān)系分析。結(jié)果表明，茵陳蒿湯含藥血清中與肝細(xì)胞損傷保護(hù)作用相關(guān)的成分包括來(lái)源于大黃的原形蒽醌類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物、來(lái)源于梔子的原形環(huán)烯醚萜類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物、來(lái)源于梔子的原形西紅花酸類成分的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，其中1個(gè)蒽醌類