茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、茵陳蒿湯源于漢代張仲景所著的《傷寒論》，由茵陳、梔子、大黃組成，具有利膽退黃、抗肝損傷、防治脂肪肝、抗肝纖維化等作用，在肝病治療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。研究茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對開發(fā)成分清楚、質(zhì)量可控、療效穩(wěn)定的創(chuàng)新中藥，從更深層次上挖掘這一經(jīng)典名方的現(xiàn)代臨床應(yīng)用價值具有重要意義。
　　中藥復(fù)方所含成分眾多，但只有那些吸收進入體內(nèi)的成分和/或其代謝產(chǎn)物（本課題組將其統(tǒng)稱為體內(nèi)“藥源性成分”）才有產(chǎn)生藥效的可能，且效應(yīng)成

2、分必須以血液為介質(zhì)輸送到靶器官或組織才能產(chǎn)生藥效。因此，有學(xué)者提出了基于“含藥血清”的中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究策略，該策略包括“血清藥理學(xué)”和“血清藥化學(xué)”研究。所謂“含藥血清”是指給動物或人服用藥物后采集的血清或血漿;“血清藥理學(xué)”指采用體外細胞模型對含藥血清進行藥效評價;“血清藥化學(xué)”指采用現(xiàn)代分析技術(shù)對含藥血清中的藥源性成分進行定性定量分析。對兩者研究結(jié)果進行相關(guān)性分析可以闡明中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　有鑒于此，本課題在

3、分別建立了茵陳蒿湯血清藥理學(xué)和血清藥化學(xué)研究方法的基礎(chǔ)上，以大鼠灌胃茵陳蒿湯全方后10個時間點采集的含藥血清和7個拆方配伍后固定時間點采集的含藥血清為研究對象，一方面測定了這17份含藥血清指紋圖譜及其中主要藥源性成分的含量，另一方面對這17份含藥血清進行了保肝活性評價，最后分別采用藥時曲線和時效曲線比較及數(shù)據(jù)處理技術(shù)對血清藥化學(xué)和血清藥理學(xué)研究結(jié)果進行了譜-效和量-效關(guān)系分析，初步闡明了茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　本論文

4、分文獻綜述和實驗研究兩大部分。
　　第一部分，文獻綜述。引用文獻213篇，分別對茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀、血清藥理學(xué)與血清藥化學(xué)相結(jié)合的中藥藥效物質(zhì)研究進展進行了文獻綜述，在此基礎(chǔ)上簡要介紹了本課題的研究思路和方案設(shè)計。
　　第二部分，實驗研究。包括以下3個方面:
　　一、茵陳蒿湯血清藥理學(xué)
　　1、茵陳蒿湯含藥血清制備方法研究
　　建立了CCl4誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠肝細胞損傷模型，以SD大鼠為

5、含藥血清供體，以含藥血清對損傷肝細胞增殖的影響為指標(biāo)，采用正交試驗法優(yōu)選了含藥血清的制備方法。結(jié)果表明，每天以成人等效劑量的10倍茵陳蒿湯提取物間隔8h分兩次給正常大鼠灌胃給藥，連續(xù)3天，末次給藥后1h采集血漿比較合理，該條件下制備的茵陳蒿湯含藥血清對肝細胞損傷具有明顯保護作用。
　　2、H2O2誘導(dǎo)的HL-7702肝細胞損傷模型的建立
　　考察了造模時間及H2O2添加濃度對細胞增殖和AST泄漏的影響，建立了H2O2誘導(dǎo)的H

6、L-7702肝細胞損傷模型。結(jié)果表明，H2O2與正常肝細胞作用4h為適宜的造模時間，0.5mmol/L和2.5mmol/L H2O2分別為細胞增殖試驗和AST泄漏檢測的適宜造模濃度。
　　3、體系中含藥血清添加量考察
　　分別將去蛋白處理的含藥血清以5％、10％、20％和40％的濃度加入培養(yǎng)體系，分別以細胞增殖和AST泄漏為指標(biāo)，考察了體系中含藥血清適宜的添加量。結(jié)果表明，體系中添加5％的含藥血清能明顯促進損傷肝細胞增殖，減

7、少AST泄漏。
　　二、茵陳蒿湯血清藥化學(xué)研究
　　1、含藥血清HPLC-UV指紋圖譜研究
　　采用HPLC法測定了10批含藥血清指紋圖譜，建立了238nm和440nm下茵陳蒿湯含藥血清指紋圖譜共有模式，并與空白血清、體外指紋圖譜和對照品指紋圖譜色譜峰的保留時間、紫外吸收光譜圖比對，對含藥血清中的藥源性成分進行了分析。結(jié)果表明，兩個波長下10批含藥血清指紋圖譜相似度良好。238nm下含藥血清指紋圖譜產(chǎn)生了9個藥源性成分

8、;440nm下產(chǎn)生了15個藥源性成分，其中4個為238nm下的共有成分。所有20個藥源性成分中，6個為體外原形成分，14個為體內(nèi)代謝產(chǎn)物。原形成分中3個分別被指認為來源于梔子的環(huán)烯醚萜類成分京尼平苷酸和梔子苷以及來源于大黃的蒽醌類成分大黃酸，另外3個原形成分中的1個為來源于大黃的蒽醌類成分，2個為來源于梔子的西紅花酸類成分。14個體內(nèi)代謝產(chǎn)物中的1個為環(huán)烯醚萜類成分的代謝產(chǎn)物、4個為蒽醌類成分的代謝產(chǎn)物、9個為西紅花酸類成分的代謝產(chǎn)物。

9、
　　2、茵陳蒿湯含藥血清中京尼平苷酸、梔子苷、大黃酸含量測定
　　建立了HPLC法測定茵陳蒿湯含藥血清中京尼平苷酸、梔子苷和大黃酸3個藥源性成分含量的方法。結(jié)果表明，京尼平苷酸、梔子苷、大黃酸分別在0.0019～0.57μg（r=0.9998）、0.0018～0.54μg(r=0.9999)、0.0016～0.48μg(r=0.9999)范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。所建立的方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強，可用于茵陳蒿湯含藥血清

10、中3個成分的含量測定。
　　三、茵陳蒿湯保肝作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的譜-效、量-效關(guān)系分析
　　1、不同時間點含藥血清保肝作用的譜-效、量-效關(guān)系分析
　　采集了大鼠灌胃茵陳蒿湯全方后10個時間點含藥血清，采用已建立的方法測定了含藥血清指紋圖譜和含藥血清中京尼平苷酸、梔子苷、大黃酸3個成分的含量，并進行了保肝活性評價，分別采用藥時曲線和時效曲線比較及數(shù)據(jù)處理技術(shù)進行了含藥血清經(jīng)時譜-效和量-效關(guān)系分析。結(jié)果表明，茵陳蒿湯含藥

11、血清中與肝細胞損傷保護作用相關(guān)的成分包括來源于大黃的原形蒽醌類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物、來源于梔子的原形環(huán)烯醚萜類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物、來源于梔子的原形西紅花酸類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物，其中2個蒽醌類成分代謝產(chǎn)物、1個原形蒽醌類成分、1個西紅花酸類成分體內(nèi)代謝產(chǎn)物活性較強。研究結(jié)果同時提示，含藥血清所含蒽醌類成分大黃酸及環(huán)烯醚萜類成分梔子苷、京尼平苷酸等可能具有肝細胞保護和損傷雙向作用，即低劑量保護高劑量則產(chǎn)生毒性。
　　2、拆方配方含

12、藥血清保肝作用的譜-效、量-效關(guān)系分析
　　采集了大鼠灌胃茵陳蒿湯7個拆方配伍后1h含藥血清，采用與全方不同時間點含藥血清相同的方法進行了指紋圖譜和含量測定及保肝活性評價，并運用數(shù)據(jù)處理技術(shù)進行了譜-效和量-效關(guān)系分析。結(jié)果表明，茵陳蒿湯含藥血清中與肝細胞損傷保護作用相關(guān)的成分包括來源于大黃的原形蒽醌類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物、來源于梔子的原形環(huán)烯醚萜類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物、來源于梔子的原形西紅花酸類成分的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，其中1個蒽醌類