蝴蝶蘭類原球莖農桿菌介導的轉基因體系構建.pdf

1、蝴蝶蘭(Phalaenopsis aphrodite)為蘭科蝴蝶蘭屬植物，其花色艷麗而豐富、形似蝴蝶而優(yōu)美，且花期長3～4個月之久，極具觀賞價值和經濟價值，在國內外市場廣受大眾喜愛。
　　本試驗前期以蝴蝶蘭組培苗葉片為誘導材料，構建了一個較為穩(wěn)定的類原球莖誘導體系，為蝴蝶蘭轉基因試驗提供了受體材料。后期以蝴蝶蘭類原球莖和組培苗葉片為受體材料，研究了侵染液濃度，侵染時間，侵染添加物質等多種因素對蝴蝶蘭遺傳轉化的影響，探索最佳遺傳轉化

2、條件。并采用農桿菌介導法成功地將目的基因轉入了蝴蝶蘭受體材料，構建了蝴蝶蘭類原球莖轉基因體系，為后續(xù)導入目的外源基因及基因功能驗證等工作奠定基礎。
　　主要研究結果如下:
　　(1)蝴蝶蘭類原球莖誘導體系的建立
　　最適葉片的選擇:生長4～5周，大小為8～12mm×10～13mm（葉寬×葉長）的蝴蝶蘭葉片是誘導PLB的較好選擇。葉基部的PLB誘導率、PLB數(shù)目、芽誘導率均最高，葉尖部和葉中部次之;故葉基部是誘導PLB的

3、較好選擇。按不同規(guī)格切割的葉片當中，規(guī)格為10mm×3mm的葉片最多長出PLB，PLB誘導率達52.78％;其次是10mm×5mm的葉片，PLB誘導率達22.22％。
　　蝴蝶蘭葉片誘導類原球莖最適培養(yǎng)基為:1/2MS+TDZ0.2mg/L+BA4mg/L+CW20％+PVP3g/L+sucrose15g/L，Phytagel3g/L，pH為5.5，其PLB誘導率達47.21％,每個葉片上誘導出PLB數(shù)目平均值為8.15個。結果表

4、明使用0～lmg/L的TDZ和0～4mg/L的BA對葉片誘導PLB都具有積極作用。
　　(2)類原球莖的增殖與分化
　　最適的類原球莖增殖培養(yǎng)基為:1/2MS+ZT3mg/L+adenine sulfate10mg/L+CW15％+peptone2g/L+sucrose15g/L+ACl g/L, Phytagel3g/L, pH為5.5。
　　最適的類原球莖分化培養(yǎng)基為:花寶+BA3mg/L+CW15％+sucros

5、e15g/L+PVP2g/L, Phytagel3g/L, pH為5.5。
　　(3)農桿菌介導的轉基因體系的構建
　　以蝴蝶蘭類原球莖為受體材料，采用植物表達載體為pCAMBIA1301（含gus報告基因和潮霉素抗性基因hpt），菌株為EHA105的根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）通過農桿菌介導法成功構建蝴蝶蘭類原球莖轉基因體系。蝴蝶蘭類原球莖預培養(yǎng)2～3d，農桿菌菌液OD為0.3，侵染時間為