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文檔簡介
1、蝴蝶蘭(Phalaenopsis aphrodite)為蘭科蝴蝶蘭屬植物,其花色艷麗而豐富、形似蝴蝶而優(yōu)美,且花期長3~4個月之久,極具觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值,在國內(nèi)外市場廣受大眾喜愛。
本試驗前期以蝴蝶蘭組培苗葉片為誘導(dǎo)材料,構(gòu)建了一個較為穩(wěn)定的類原球莖誘導(dǎo)體系,為蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因試驗提供了受體材料。后期以蝴蝶蘭類原球莖和組培苗葉片為受體材料,研究了侵染液濃度,侵染時間,侵染添加物質(zhì)等多種因素對蝴蝶蘭遺傳轉(zhuǎn)化的影響,探索最佳遺傳轉(zhuǎn)化
2、條件。并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將目的基因轉(zhuǎn)入了蝴蝶蘭受體材料,構(gòu)建了蝴蝶蘭類原球莖轉(zhuǎn)基因體系,為后續(xù)導(dǎo)入目的外源基因及基因功能驗證等工作奠定基礎(chǔ)。
主要研究結(jié)果如下:
(1)蝴蝶蘭類原球莖誘導(dǎo)體系的建立
最適葉片的選擇:生長4~5周,大小為8~12mm×10~13mm(葉寬×葉長)的蝴蝶蘭葉片是誘導(dǎo)PLB的較好選擇。葉基部的PLB誘導(dǎo)率、PLB數(shù)目、芽誘導(dǎo)率均最高,葉尖部和葉中部次之;故葉基部是誘導(dǎo)PLB的
3、較好選擇。按不同規(guī)格切割的葉片當(dāng)中,規(guī)格為10mm×3mm的葉片最多長出PLB,PLB誘導(dǎo)率達(dá)52.78%;其次是10mm×5mm的葉片,PLB誘導(dǎo)率達(dá)22.22%。
蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)類原球莖最適培養(yǎng)基為:1/2MS+TDZ0.2mg/L+BA4mg/L+CW20%+PVP3g/L+sucrose15g/L,Phytagel3g/L,pH為5.5,其PLB誘導(dǎo)率達(dá)47.21%,每個葉片上誘導(dǎo)出PLB數(shù)目平均值為8.15個。結(jié)果表
4、明使用0~lmg/L的TDZ和0~4mg/L的BA對葉片誘導(dǎo)PLB都具有積極作用。
(2)類原球莖的增殖與分化
最適的類原球莖增殖培養(yǎng)基為:1/2MS+ZT3mg/L+adenine sulfate10mg/L+CW15%+peptone2g/L+sucrose15g/L+ACl g/L, Phytagel3g/L, pH為5.5。
最適的類原球莖分化培養(yǎng)基為:花寶+BA3mg/L+CW15%+sucros
5、e15g/L+PVP2g/L, Phytagel3g/L, pH為5.5。
(3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建
以蝴蝶蘭類原球莖為受體材料,采用植物表達(dá)載體為pCAMBIA1301(含gus報告基因和潮霉素抗性基因hpt),菌株為EHA105的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功構(gòu)建蝴蝶蘭類原球莖轉(zhuǎn)基因體系。蝴蝶蘭類原球莖預(yù)培養(yǎng)2~3d,農(nóng)桿菌菌液OD為0.3,侵染時間為
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