梅毒螺旋體核酸檢測(cè)及基于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的梅毒螺旋體核酸絕對(duì)定量方法學(xué)研究.pdf

1、第一部分：各期梅毒外周血中梅毒螺旋體核酸檢出率的研究
　　目的：利用巢式PCR技術(shù)探究各期梅毒患者外周血中梅毒螺旋體DNA的檢出率。
　　方法：臨床收集192例梅毒患者外周血樣本，其中包括37例一期梅毒，92例二期梅毒，63例潛伏梅毒，利用TP0105和TP0574基因片段特異的內(nèi)外引物，行巢式PCR技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：一期梅毒患者外周血中梅毒螺旋體的檢出率為45.9%（TP0105）和40.5%（TP05

2、74），兩基因的總檢出率為48.6%；二期梅毒患者外周血中梅毒螺旋體的檢出率為52.2%（TP0105）和52.2%（TP0574），兩基因的總檢出率為62.0%；潛伏梅毒患者外周血中梅毒螺旋體的檢出率為6.3%（TP0105）和4.8%（TP0574），兩基因的總檢出率為7.9%。兩基因的檢出率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有差異（P<0.05），Kappa值為0.714。
　　結(jié)論：梅毒螺旋體基因可以在螺旋體感染的各個(gè)階段的梅毒患者外周血中檢測(cè)

3、到，其中在一期梅毒和二期梅毒中的檢出率最高。巢式PCR技術(shù)在早期梅毒的診斷中起到了重要的作用，可以在臨床上用于暗視野鏡檢和血清學(xué)檢測(cè)的補(bǔ)充診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　第二部分：基于微滴式數(shù)字 PCR技術(shù)的梅毒螺旋體核酸絕對(duì)定量方法的建立及應(yīng)用
　　微滴式數(shù)字PCR技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)基于單分子PCR方法來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，目前基于該技術(shù)的梅毒螺旋體絕對(duì)定量方法還未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究建立了微滴式數(shù)字PCR梅毒螺旋體

4、核酸絕對(duì)定量檢測(cè)平臺(tái)，從特異性、靈敏度、可信度、重復(fù)性幾個(gè)方面對(duì)平臺(tái)進(jìn)行評(píng)估，又將建立好的ddPCR檢測(cè)平臺(tái)應(yīng)用于TP感染兔模型外周血的核酸檢測(cè)，確定該技術(shù)的可行性。
　　本研究設(shè)計(jì)了針對(duì)基因分別為TP0105和TP0574的特異性探針，利用ddPCR技術(shù)檢測(cè)了健康人、非梅毒病人、正常兔、鼠血漿中的目的基因片段，確定了該技術(shù)的空白下限值（LOB）為3.2copies（TP0105）和1.4copies（TP0574），為后續(xù)對(duì)于臨

5、床樣本的檢測(cè)確定了cut-off值。用ddPCR技術(shù)對(duì)各稀釋梯度的質(zhì)粒進(jìn)行核酸定量檢測(cè)，確定該檢測(cè)技術(shù)的高靈敏度，最低檢測(cè)下限（LOD）為單拷貝。將每個(gè)梯度質(zhì)粒經(jīng)ddPCR檢測(cè)出的實(shí)際拷貝數(shù)與計(jì)算出的理論拷貝數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)二者呈高度相關(guān)性，說(shuō)明 ddPCR技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果是可信的。為了評(píng)估ddPCR的重復(fù)性，我們對(duì)各稀釋梯度兔睪丸懸液的檢測(cè)均進(jìn)行了三次重復(fù)，對(duì)三次拷貝數(shù)結(jié)果進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)每個(gè)稀釋梯度的RSD值均在可接受的范圍內(nèi)，表

6、明 ddPCR具有很好的可重復(fù)性。在ddPCR與qPCR的對(duì)比研究中我們發(fā)現(xiàn)ddPCR具有比qPCR更低的檢測(cè)下限，靈敏度更高，且ddPCR具有比qPCR更好的重復(fù)性，特別是在目的基因處于低拷貝的情況下。
　　本研究利用ddPCR技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了兔模型對(duì)TP的感染情況，發(fā)現(xiàn)感染兔外周血中核酸水平的出現(xiàn)早于血清學(xué)水平，證實(shí)了ddPCR技術(shù)的可行性，為后續(xù)對(duì)于臨床樣本的核酸絕對(duì)定量研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)指導(dǎo)用于極早期梅毒、胎傳梅毒、神經(jīng)梅毒