梅毒螺旋體膜蛋白的表達(dá)、純化及其免疫活性的研究.pdf

1、研究背景及目的
　　 梅毒螺旋體膜蛋白在細(xì)胞間接觸、表面識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性和運(yùn)輸?shù)确矫娑及缪葜匾慕巧?，通過對梅毒螺旋體重組抗原的研究有利于鑒別并篩選可用于梅毒早期實(shí)驗(yàn)室診斷及疫苗研制的候選抗原，同時對于深入研究梅毒的發(fā)病機(jī)制、了解在梅毒螺旋體感染過程中宿主．病原菌的相互關(guān)系，具有重要意義。然而，資料表明，對梅毒螺旋體膜蛋白的研究一直較為困難，研究結(jié)果也存在著爭議，為此我們利用基因工程技術(shù)，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，分別對Tp

2、0965、Tp0136及Tp0608三種蛋白進(jìn)行表達(dá)，對表達(dá)出的蛋白進(jìn)行相關(guān)免疫活性的檢測，并探討重組蛋白Tp0965作為包被抗原建立間接ELISA的方法應(yīng)用于梅毒診斷的可行性。
　　 研究方法
　　 使用Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株接種家兔睪丸，制備Tp Nichols菌株DNA，PCR擴(kuò)增Tp0965、Tp0608基因，Tp0136基因采用全基因合成的方法；構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a/Tp0965、Tp0136及Tp0

3、608，分別進(jìn)行BamHI/SaI1、BamHI/HindⅢ及NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確后大腸桿菌轉(zhuǎn)化，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE和Western blot鑒定，并純化重組蛋白，BCA法檢測重組蛋白濃度。用純化的重組蛋白Tp0965、Tp0136免疫新西蘭兔，并以該重組蛋白作為包被抗原建立間接ELISA法以檢測免疫兔的多克隆抗體效價；Western blot檢測重組的Tp0965、Tp0136及Tp0608與梅毒陽

4、性血清的免疫反應(yīng)。以重組蛋白Tp0965為包被抗原建立間接ELISA檢測各期梅毒患者血清。
　　 研究結(jié)果
　　 (1)成功構(gòu)建目的基因與E．coli表達(dá)質(zhì)粒載體pET28，成功表達(dá)和純化出具有較高純度和濃度的膜蛋白Tp0965、Tp0136及Tp0608。
　　 (2)用重組蛋白Tp0136免疫新西蘭兔，在免疫2周后即能檢測到抗體的產(chǎn)生，免疫3次后產(chǎn)生高效價抗體；而重組蛋白Tp0965只有在免疫3次以后，才能刺

5、激兔產(chǎn)生較低效價的抗體。
　　 (3)Western blot實(shí)驗(yàn)顯示三種重組蛋白Tp0965、Tp0136及Tp0608均能與梅毒陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在電泳圖上有特異性條帶出現(xiàn)。
　　 (4)以重組蛋白Tp0965作為包被抗原建立間接ELISA診斷各期梅毒，陽性率高達(dá)94.6％，而與梅毒陰性血清不能結(jié)合。
　　 結(jié)論
　　 (1)能夠通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組出具有全基因片段長度的膜蛋白Tp0965、