人類弱精子癥精子的容積調(diào)節(jié)能力、運(yùn)動(dòng)能力和氯通道的表達(dá).pdf

1、目的：闡明調(diào)節(jié)精子功能的機(jī)制是診斷和治療男性不育、開發(fā)新型男性避孕手段的先決條件。容積調(diào)節(jié)能力對于精子的生理功能至關(guān)重要，容積敏感性氯通道是決定精子調(diào)節(jié)能力的關(guān)鍵因素之一，參與健康精子細(xì)胞在低滲環(huán)境中的容積調(diào)節(jié)過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，不育小鼠精子的容積調(diào)節(jié)能力明顯降低。然而人類弱精子的容積調(diào)節(jié)能力以及氯通道的表達(dá)情況尚不清楚。
　　本研究旨在研究人類弱精子癥精子在低滲環(huán)境中的容積調(diào)節(jié)能力，以及氯通道在精子容積調(diào)節(jié)和運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮的作用，并

2、探討容積敏感性氯通道在弱精子的表達(dá)及其在運(yùn)動(dòng)中的作用，為臨床治療男性不育以及開發(fā)離子通道型男性避孕藥提供理論依據(jù)。
　　方法：1）根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）出版的《人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊（第五版）》中實(shí)驗(yàn)方法，采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）進(jìn)行精液常規(guī)分析；2）正常精子和弱精子精液樣本均由廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院男性實(shí)驗(yàn)室和人類精子庫提供；3）用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）檢測精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)，如精子的前向運(yùn)動(dòng)

3、(PR)百分比、直線運(yùn)動(dòng)速率(VSL)、曲線運(yùn)動(dòng)速率(VCL)、平均路徑速率(VAP)；4）根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)檢測到的前向散射信號來反映精子的容積變化；5）用激光共聚焦免疫熒光技術(shù)檢測氯通道在精子上的表達(dá)與定位，并用流式細(xì)胞術(shù)分析精子氯通道的相對表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　在等滲液（BWW330）中，正常精子細(xì)胞容積維持穩(wěn)定，改用低滲液（BWW290）孵育，正常人的精子容積幾乎沒有變化（P>0.05），表明正常精子在低滲環(huán)境中能夠

4、有效地調(diào)節(jié)自身的容積，恢復(fù)細(xì)胞的正常大小。然而弱精子在低滲液中的容積明顯變大（P<0.01），表明在低滲環(huán)境下，弱精子不能有效地調(diào)節(jié)自身的容積。提示弱精子的容積調(diào)節(jié)機(jī)制異常，導(dǎo)致容積調(diào)節(jié)能力減弱。
　　氯通道阻斷劑5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid NPPB(100?mol/L)和4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid

5、DIDS(100?mol/L)均可以顯著地抑制正常精子在低滲環(huán)境中的調(diào)節(jié)性容積回縮能力（P<0.01），導(dǎo)致正常精子的容積增大；而對弱精子的容積幾乎沒有影響（P>0.05），表明弱精子對氯通道阻斷劑不敏感，提示弱精子的氯通道表達(dá)（表達(dá)量或類型）異常。
　　細(xì)胞外滲透壓從330 mOsm/kg降低到290 mOsm/kg時(shí)，正常精子的多項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)如前向運(yùn)動(dòng)(PR)百分比、直線運(yùn)動(dòng)速率(VSL)、曲線運(yùn)動(dòng)速率(VCL)、平均路徑速率(

6、VAP)的數(shù)值均明顯增加，表明正常精子在低滲液中的的運(yùn)動(dòng)明顯增強(qiáng)，而弱精子動(dòng)參數(shù)如前向運(yùn)動(dòng)(PR)百分比、直線運(yùn)動(dòng)速率(VSL)、曲線運(yùn)動(dòng)速率(VCL)、平均路徑速率(VAP)的數(shù)值均明顯減小，表明弱精子在低滲液中的運(yùn)動(dòng)則顯著減弱。
　　NPPB和DIDS在等滲液（BWW330）和低滲液（BWW290）中均明顯抑制正常精子和弱精子的運(yùn)動(dòng)，其中DIDS的抑制作用比NPPB更強(qiáng)，NPPB在BWW290中對正常精子運(yùn)動(dòng)的抑制作用大于弱精

7、子。結(jié)果提示氯通道的激活在精子運(yùn)動(dòng)過程中起重要作用。
　　流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，弱精子 ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)量明顯低于正常精子。進(jìn)一步用激光共聚焦免疫熒光技術(shù)定位分析 ClC-3氯通道在精子細(xì)胞中的分布，結(jié)果顯示，ClC-3氯通道蛋白在正常精子和弱精子的頸部及尾部均有表達(dá)，但弱精子頸部 ClC-3的表達(dá)明顯弱于正常精子細(xì)胞（P<0.01）。
　　用免疫熒光技術(shù)，在正常精子和弱精子細(xì)胞中均檢測不到ClC-5和ClC-