特發(fā)性弱畸精子癥精子蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:特發(fā)性弱畸精子癥屬于臨床上常見(jiàn)的男性不育疑難癥,其發(fā)病機(jī)理不明,目前缺乏特效的治療方法,是臨床男科醫(yī)生十分關(guān)注的熱點(diǎn)之一。特發(fā)性弱畸精子癥導(dǎo)致的精液質(zhì)量下降,直接影響男性生育能力的高低。人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成使人們意識(shí)到大部分的生物學(xué)變化發(fā)生在蛋白質(zhì)水平而非基因水平。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法了解疾病狀態(tài)下的蛋白質(zhì)表達(dá)譜,可發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的一種蛋白質(zhì)或生物標(biāo)志物或一組蛋白質(zhì);蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在男性生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用卻尚屬初級(jí)階段,缺少

2、大量有價(jià)值的信息和結(jié)果。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的主要技術(shù)之一即雙向電泳技術(shù),對(duì)觀察組特發(fā)性弱畸精子癥和健康供精者對(duì)照組的精液標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳后得到差異蛋白圖譜,利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)和蛋白質(zhì)分析軟件進(jìn)行對(duì)比分析,進(jìn)行差異蛋白質(zhì)功能鑒定,再?gòu)牟町惖鞍椎墓δ苋リU述特發(fā)性弱畸精子癥發(fā)病機(jī)理。
　　方法:本研究使用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取特發(fā)性弱畸精子癥患者(90例)和健康供精者(90例)精液標(biāo)本,分為觀察組(特發(fā)性弱畸精子癥患者)和對(duì)照組(

3、健康供精者)。采用尿素鹽酸胍裂解法對(duì)兩組標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)提抽,將提取所得的精子蛋白質(zhì),進(jìn)行雙向凝膠電泳(2-DE two-dimensional electrophoresis),對(duì)雙向電泳所得的蛋白質(zhì)凝膠進(jìn)行硝酸銀法染色、固定、漂洗和用高分辨率GS-800光密度掃描儀進(jìn)行掃描,顯示精子蛋白質(zhì)雙向凝膠圖譜,再利用蛋白質(zhì)分析軟件 PDQuest?2-D Analysis Software對(duì)特發(fā)性弱畸精子癥患者和健康對(duì)照組的精子蛋白質(zhì)做對(duì)比觀

4、察,找出有差異性的蛋白點(diǎn),再對(duì)差異蛋白點(diǎn)凝膠進(jìn)行挖點(diǎn)后,送蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、功能鑒定。數(shù)據(jù)結(jié)果采用spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:不同標(biāo)本之間的雙向電泳圖譜很相似,將健康供精者精子圖譜和特發(fā)性弱畸精子癥的圖譜分別進(jìn)行匹配,蛋白質(zhì)平均匹配點(diǎn)數(shù)分別為570±169和567±131,平均匹配率為68.2％和62.17％。健康供精者組和特發(fā)性弱畸精子癥組分別檢出共有蛋白質(zhì)點(diǎn)為938個(gè)和998

5、個(gè)。兩張參考膠的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行匹配,結(jié)果顯示健康供精者精子和特發(fā)性弱畸精子癥精子電泳圖譜有546個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)相互匹配。再任意選取同組6塊膠中相互匹配且分辨清晰的42個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),將位置接近中央的點(diǎn)定為原點(diǎn),以參考膠為參考位置,測(cè)量出其他5塊膠對(duì)應(yīng)點(diǎn)在第1向等電聚焦(IEF)和第2向SDA-PAGE方向上的偏差,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組16塊膠的蛋白質(zhì)點(diǎn)在位置上有較好的重復(fù)性。對(duì)健康供精者精子和特發(fā)性弱畸精子癥精子電泳圖中相互匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行差異分析后發(fā)

6、現(xiàn),如果按照5倍的表達(dá)量計(jì)算,差異點(diǎn)為9個(gè),其中6個(gè)點(diǎn)在正常精子中高表達(dá),另外3個(gè)點(diǎn)在特發(fā)性弱畸精子癥精子中高表達(dá);如果按照2倍的表達(dá)量計(jì)算,差異點(diǎn)為99個(gè),其中51個(gè)特發(fā)性弱畸精子癥精子中高表達(dá),另外49個(gè)點(diǎn)在正常精子中高表達(dá)。差異顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定為,C35,C37;C35的數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為Q9Y5X2,為Sorting nexin-8[SNX8],是一種新的分揀微管連接素,可能參與胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)囊恍╇A段。C37

7、的數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào) Q9NQH7,為 PutativeXaa-Proaminopeptidase3[XPNPEP3],是一種氨肽酶,具有水解多肽(甚至二肽)釋放 N端氨基酸(包括脯氨酸)的作用。C35,C37蛋白的直接或間接地與特發(fā)性弱畸精子癥發(fā)病相關(guān),影響到精子的數(shù)量、形態(tài)和功能。
　　結(jié)論:使用的尿素+鹽酸胍裂解法裂解法裂解精子含量明顯增高,能夠滿(mǎn)足2-DE電泳的要求上樣量;裂解效率高,且方法實(shí)用,成本低。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了正常精子與