EGR1、PRP相關生長因子對兔肩袖損傷后肌腱修復的影響.pdf

1、目的：
　　研究EGR1對肌腱干細胞的誘導分化能力及EGR1、PRP相關生長因子對兔肩袖損傷后肌腱修復的影響。
　　方法：
　　(1)采用酶消化法取新西蘭大白兔髕韌帶中間部分肌腱組織，經過酶切處理及培養(yǎng)后分離、純化得到肌腱干細胞（TSCs），之后免疫熒光染色檢測4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、TNMD抗體和SCX抗體并在熒光顯微鏡下觀察進一步證實鑒定TSCs細胞。
　　(2)用帶有表達 EGR1基因的質

2、粒（pCDNA-EGR1）轉染實驗組 TSCs，用空白質粒轉染對照組 TSCs。應用短片段發(fā)夾 RNA（shRNA）lentiviral微粒靶向干擾TSCs中BMP12和Smad1基因的表達。在EGR1的作用下實驗組和對照組的TSCs分別誘導培養(yǎng)14天向肌腱細胞分化，分離純化得到肌腱細胞，應用免疫熒光染色和定量PCR對肌腱細胞進行鑒定，并對其相關基因表達進行檢測。
　　(3)通過RNA提取與實時定量PCR檢測（qRT-PCR），在

3、基因水平比較實驗組和對照組 TSCs分化生成肌腱細胞的能力，并在 TSCs分化培養(yǎng)過程中（0h,12h,1d,3d,7d,14d）提取蛋白質并應用 Western blotting檢測：通過BMP12/Smad1/5/8通路生成的蛋白產物并與正常肌腱愈合時產生這些產物作比較。
　　(4)建立兔肩袖損傷模型（共40只），每只實驗動物切斷右側肩關節(jié)岡上肌肌腱，對左側肩關節(jié)行假手術處理形成對照組。損傷模型建立后6周行肩袖修補手術，并將實

4、驗動物分為三組（每組10只）：A組，單純修補手術；B組，修補手術+TSCs植入（肌腱損傷部位）；C組，修補手術+EGR1-TSCs植入（肌腱損傷部位）+PRP注射（肌腱-骨界面）。肩袖修補手術后8周，處死所有組實驗動物，獲取每只實驗動物雙側肱骨大結節(jié)連同附著于其上的岡上肌肌腱。每組取出3分樣本用于mRNA提取和蛋白質提取（用于Western blotting）；每組中剩余組織樣本（包括取自手術修補部位的岡上肌肌腱及肱骨大結節(jié)）制成5μm

5、厚的石蠟切片，進行HE染色、免疫組化分析及來評估I型膠原蛋白的形成情況，評價肌腱的愈合情況。
　　結果：
　　(1) TSCs肌腱干細胞培養(yǎng)成功，DAPI標記的第三代TSCs細胞核可見明亮藍色熒光（圖3），標記率達100％，細胞活性較高。NMD、SCX染色細胞質呈綠色熒光，可觀察細胞整體形態(tài)及分布狀況良好。
　　(2)實驗組TSCs表達EGR1基因，對照組TSCs無表達。短片段發(fā)夾RNA（shRNA） lentivir

6、al微粒靶向干擾TSCs中分化成功，分離純化得到肌腱細胞，免疫熒光染色和定量PCR對肌腱細胞進行鑒定顯示為肌腱細胞。
　　(3) RNA與實時定量PCR檢測（qRT-PCR），顯示實驗組TSCs分化生成肌腱細胞并應用Western blotting檢測，得到BMP12/Smad1/5/8通路生成的蛋白產物并與正常細胞相同。
　　(4)兔肩袖損傷模型建立成功，HE染色、免疫組化分析均顯示I型膠原蛋白的形成情況良好，肌腱的愈合情