齊墩果酸衍生物DKS26的抗糖尿病作用及其機制研究.pdf

1、研究目的：
　　天然化合物齊墩果酸(OA)具有降糖、降脂、保肝、抗炎等多種藥理活性，其降糖作用與促進腸促胰素胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）分泌有關。但是OA的體內降糖作用較弱，并存在潛在的肝毒性，限制了其在糖尿病治療中的應用。DKS26是一種新的齊墩果酸衍生物，本論文系統(tǒng)研究其體內外抗糖尿病作用，同時考察它對糖尿病小鼠的肝保護作用，以及對正常小鼠的用藥安全性;論文還針對DKS26的促GLP-1分泌作用，進一步探討其潛在的抗糖尿病

2、分子作用機制，為其開發(fā)成新型糖尿病治療藥物提供實驗依據(jù)和理論指導。
　　研究方法：
　　1.DKS26的體外藥效學研究
　　(1)DKS26對人肝HepG2細胞葡萄糖消耗的影響
　　采用葡萄糖氧化酶法檢測DKS26對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響。試驗分組為:溶劑對照組、二甲雙胍1mM陽性對照組、OA0.1μM、1μM、10μM對照組和DKS260.1μM、1μM、10μM受試組。
　　(2)DKS26對游

3、離脂肪酸(FFAs)誘導脂質蓄積HepG2細胞脂質水平的影響
　　采用甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒和油紅O染色法檢測DKS26對FFAs誘導脂質蓄積HepG2細胞脂質水平的影響。試驗分組為:正常對照組、FFAs0.25mM模型對照組、苯扎貝特10μM陽性對照組、二甲雙胍1mM對照組、OA10μM對照組和DKS2610μM受試組。
　　2.DKS26的體內藥效學研究
　　(1)DKS26對STZ誘發(fā)糖尿

4、病小鼠的影響
　　ICR小鼠經腹腔注射130mg/kg STZ誘導糖尿病模型(空腹血糖≥11.1mmol/L)。糖尿病小鼠按血糖值大小隨機分為4組，分別為STZ模型對照組（n=7）、二甲雙胍100mg/kg陽性對照組(n=8)、OA100mg/kg對照組(n=8)和DKS26100mg/kg受試組(n＝8)。同時另設正常小鼠對照組(n＝5)，與STZ模型對照組同樣給予與給藥組等體積的0.5％CMC-Na。
　　(2)DKS2

5、6對db/db糖尿病小鼠的影響
　　db/db小鼠（空腹血糖≥11.1mmol/L）按血糖隨機分為4組，每組7-8只，分別為db/db模型對照組(0.5％CMC-Na)、二甲雙胍100mg/kg陽性對照組、OA100mg/kg對照組和DKS26100mg/kg受試組。
　　3.DKS26的抗糖尿病分子作用機制研究
　　(1)DKS26對GLP-1表達與分泌的影響
　　采用ELISA法，觀察DKS26對腸道內分泌N

6、CI-H716細胞培養(yǎng)上清液和上述兩種糖尿病小鼠血漿GLP-1水平的影響。分別采用免疫熒光法、RT-PCR法、ELISA法和Western Blot法，觀察DKS26對NCI-H716細胞和小鼠腸道組織GLP-1蛋白原位表達、GLP-1相關基因(gcg和PC3)表達、cAMP含量和p-PKA及PKA蛋白表達的影響。
　　(2)DKS26對人源G蛋白偶聯(lián)膽汁酸膜受體(TGR5)的影響
　　采用體外報告基因系統(tǒng)篩選模型HEK29

7、3/pGL4.29/hTGR5細胞檢測DKS26對人源TGR5(hTGR5)的影響。分組為:空白對照組、INT-777陽性對照組、OA對照組和DKS26受試組。
　　4.DKS26對正常小鼠肝功能的影響
　　DKS26對正常ICR小鼠連續(xù)給藥后，觀察小鼠血漿ALT、AST、TBA水平的變化，以考察其對正常小鼠肝功能的影響。分組為:溶劑對照組0.5％CMC-Na、二甲雙胍100mg/kg對照組、OA100mg/kg對照組和DK

8、S26100mg/kg受試組。
　　研究結果：
　　1.DKS26的體外藥效學研究
　　(1)DKS26對人肝HepG2細胞葡萄糖消耗的影響
　　DKS26可明顯增加肝HepG2細胞葡萄糖消耗，該作用與陽性對照藥二甲雙胍相當。
　　(2)DKS26對FFAs誘導脂質蓄積HepG2細胞脂質水平的影響
　　DKS26可降低FFAs誘導脂質蓄積肝HepG2細胞TG、TC水平，并減少細胞內脂滴含量。
　

9、　2.DKS26的體內藥效學研究
　　(1)DKS26對STZ誘發(fā)糖尿病小鼠的影響
　　DKS26可明顯降低STZ誘發(fā)糖尿病小鼠血漿葡萄糖、GSP和脂質水平，改善OGT，并減少飲水量、攝食量，其降血糖作用與二甲雙胍相當，明顯強于OA;它可增加血漿胰島素水平和改善胰島組織形態(tài);還可降低血漿ALT、AST和ALP水平，減少肝臟脂質水平，改善肝臟組織病理形態(tài)和抑制肝臟炎癥相關基因表達。此外，DKS26可降低小鼠血漿D-BIL和T-

10、BIL水平以及D-BIL/T-BIL比值，降低血漿TBA，同時可縮小模型小鼠增大的膽囊。
　　(2)DKS26對db/db糖尿病小鼠的影響
　　DKS26可明顯降低db/db小鼠血漿葡萄糖、GSP和脂質水平，改善OGT，減少飲水量，其降糖和改善OGT的作用與二甲雙胍相當，明顯強于OA;它可增加血漿胰島素水平，改善胰島組織形態(tài);還可降低血漿ALT、AST和ALP水平，減少肝臟脂質水平，改善肝臟組織病理形態(tài)和抑制肝臟炎癥相關基因

11、的表達。此外，DKS26對小鼠血漿TBA水平和膽囊大小無明顯影響;對血漿D-BIL和T-BIL雖有降低作用，但對二者的比值無明顯影響。
　　3.DKS26的抗糖尿病分子作用機制研究
　　(1)DKS26對GLP-1表達與分泌的影響
　　DKS26可增加NCI-H716細胞上清液中GLP-1含量，增加細胞內GLP-1蛋白和GLP-1相關基因(gcg和PC3)的表達，并升高細胞內cAMP和p-PKA蛋白的水平。它也可增加S

12、TZ誘發(fā)糖尿病小鼠和db/db小鼠血漿GLP-1水平，促進腸道gcg和PC3的表達，同時升高腸道內cAMP和p-PKA蛋白的水平，此外還可增加STZ誘發(fā)糖尿病小鼠腸道GLP-1蛋白的原位表達。
　　(2)DKS26對人源G蛋白偶聯(lián)膽汁酸膜受體(TGR5)的影響
　　DKS26在最高濃度100μM時對hTGR5仍無激動效應，而OA對hTGR5具有較弱的激動效應(OA EC50=13.659±1.812μM，陽性對照化合物INT

13、-777EC50=1.765±0.452μM)。
　　4.DKS26對正常小鼠肝功能的影響
　　DKS26連續(xù)給藥對正常小鼠血漿ALT、AST和TBA水平均無明顯影響，但相同劑量的OA可增高這些肝功能損傷相關指標的血漿水平。
　　研究結論：
　　齊墩果酸衍生物DKS26在體內外均具有良好的抗糖尿病作用，其作用機制可能與激活腸道cAMP/PKA信號通路促進GLP-1分泌與表達有關，也可能與激活肝臟AMPK信號通路調

14、節(jié)糖脂代謝有關。此外，DKS26對糖尿病小鼠具有肝保護作用，其用藥安全性高于齊墩果酸。
　　1.DKS26可增加入肝HepG2細胞葡萄糖消耗，減少FFAs誘導脂質蓄積肝HepG2細胞內脂質水平，其作用機制可能與激活肝AMPK信號通路，下調PEPCK和G6Pase表達、上調GLUT2表達從而降低糖異生、增加糖攝取，以及抑制SREBP-1c和FAS表達、增加PPARα和CPT1表達從而抑制脂肪酸合成、促進脂肪酸氧化有關。
　　2

15、.DKS26連續(xù)給藥33天可降低STZ誘發(fā)糖尿病小鼠的空腹血糖和血脂水平，改善OGT，其降血糖作用與二甲雙胍相當，強于OA;可減少飲水量、攝食量改善糖尿病小鼠多飲、多食的癥狀;可增加血漿胰島素水平，改善胰島組織形態(tài)發(fā)揮胰島保護作用;可改善肝功能、肝臟組織病理形態(tài)、肝臟脂質蓄積和肝臟炎癥狀態(tài)發(fā)揮護肝作用。此外，DKS26可降低小鼠血漿TBA水平，減小膽囊，提示其對STZ誘發(fā)的糖尿病小鼠用藥無膽汁淤積與膽囊充盈的風險。
　　3.DKS

16、26連續(xù)給藥30天可降低db/db糖尿病小鼠的空腹、隨機血糖和血脂水平，其降血糖作用與二甲雙胍相當，強于OA;可改善OGT，該作用優(yōu)于OA;可降低飲水量改善糖尿病小鼠多飲的癥狀;可增加血漿胰島素水平，改善胰島組織形態(tài)發(fā)揮胰島保護作用;可改善肝功能、肝臟組織病理形態(tài)、肝臟脂質蓄積和肝臟炎癥狀態(tài)發(fā)揮護肝作用。此外，DKS26對血漿TBA水平和膽囊大小無明顯影響，提示其對db/db糖尿病小鼠用藥誘發(fā)膽汁酸淤積與膽囊充盈的風險較低。
　　

17、4.DKS26可促進腸道內分泌NCI-H716細胞GLP-1的表達與分泌，其作用機制可能與激活cAMP/PKA信號通路有關。DKS26可增加STZ誘發(fā)糖尿病小鼠和db/db糖尿病小鼠血漿GLP-1水平，促進腸道GLP-1蛋白和相關基因(gcg和PC3)的表達，并激活腸道cAMP/PKA信號通路，表明其降血糖、降血脂和胰島保護的作用機制可能與促GLP-1分泌與表達有關。
　　5.DKS26可激活STZ誘發(fā)糖尿病小鼠和db/db糖尿病