循環(huán)腫瘤細(xì)胞非標(biāo)記高通量分選與富集關(guān)鍵技術(shù)研究與儀器研制.pdf

1、癌癥早期診斷對癌癥研究具有重要的指導(dǎo)意義。作為腫瘤早期轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)，人體外周血中的稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量可用于預(yù)測癌癥患者的生存期，因此從血液中快速捕獲并富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞成為癌癥診療的關(guān)鍵。鑒于上述需求，本論文基于微流控技術(shù)研制了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞非標(biāo)記高通量分選與富集儀器。針對儀器研制過程中的關(guān)鍵技術(shù)問題，本論文主要從以下幾方面展開研究:
　　(1)開展微流控被動流量調(diào)節(jié)機理研究、流量調(diào)節(jié)閥研制與性能測試:為實現(xiàn)微流體的精確控制，

2、提出一種新型結(jié)構(gòu)的微流控被動流量調(diào)節(jié)閥以自動調(diào)控流體流量。首先，采用多物理場仿真軟件COMSOL Multiphysics對微閥進行三維流固耦合建模，仿真結(jié)果顯示微閥具有明顯的非線性壓力流量特性。其次，基于仿真數(shù)據(jù)，設(shè)計并制作一系列不同尺寸的微閥原型器件，測試微閥在液體回路系統(tǒng)中的壓力流量數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)微閥在不穩(wěn)定的驅(qū)動壓力下具有顯著的恒流量特性。接著，研究微閥的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)參數(shù)對輸出流量的影響，發(fā)現(xiàn)微閥的控制流道越寬或直通流道的截面積越小，微

3、閥的流量也越小，該規(guī)律為設(shè)計不同流量數(shù)據(jù)的微閥提供了經(jīng)驗指導(dǎo)。最后，研究微閥在氣體回路系統(tǒng)中的壓力阻尼效應(yīng)，建立氣路系統(tǒng)的低通濾波模型，發(fā)現(xiàn)氣路系統(tǒng)的阻尼能力隨著氣體容積和氣壓頻率的增大而增強。
　　(2)開展氣壓驅(qū)動流系統(tǒng)中的粒子慣性分選行為研究，并開發(fā)低成本進樣、驅(qū)動與分選系統(tǒng):為實現(xiàn)儀器的輕量化、便攜式設(shè)計，摒棄微流控實驗中昂貴、笨重的精密注射泵，提出一種低成本的氣壓驅(qū)動流系統(tǒng)用于混合粒子樣品液的進樣、驅(qū)動與粒子分選。首先，

4、設(shè)計并制作一種慣性微流控芯片（即DFF芯片），單獨測試5μm聚苯乙烯粒子經(jīng)Dean流聚焦運動至流道出口外壁面處和15μm粒子經(jīng)慣性聚焦至流道出口內(nèi)壁面處所需的鞘液和樣品液流量?；谏鲜隽髁繑?shù)據(jù)，測試5μm和15μm混合粒子實現(xiàn)分選所需的流量條件，獲得粒子精確分選所需的最佳流量參數(shù)。其次，設(shè)計并搭建氣壓驅(qū)動流系統(tǒng)，采用低壓壓縮氣體作為驅(qū)動微流體的動力源，并在系統(tǒng)中集成微閥與DFF芯片。最后，研究DFF芯片中混合粒子的運動軌跡，發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定

5、的驅(qū)動壓力下混合粒子始終可以保持精確、穩(wěn)定的分選，表明在氣壓驅(qū)動流系統(tǒng)中集成微閥可以實現(xiàn)微流體的精確進樣，為后續(xù)開發(fā)儀器控制系統(tǒng)提供了實驗依據(jù)。
　　(3)開展熱塑性聚合物薄膜芯片制備工藝研究，并研制集成被動流量調(diào)節(jié)閥的細(xì)胞高通量分選器件:為制作低成本、可拋棄式芯片，提出一種熱塑性聚合物薄膜芯片。首先，采用UV激光切割與熱塑封的方法對芯片進行快速制作，分別研究激光和塑封參數(shù)對芯片流道截面尺寸的影響，得到制作芯片的最佳工藝參數(shù)?；?/p>

6、上述參數(shù)，制作DFF薄膜芯片，測試芯片分選5μm、7μm、15μm和20μm混合粒子所需的鞘液和樣品液流量，并驗證芯片可以有效分選人體血液中的乳腺癌細(xì)胞MCF-7。其次，基于薄膜芯片原理，設(shè)計并制作細(xì)胞高通量分選器件，該器件集成八個并行的螺旋流道，通量達到12ml/min以上。設(shè)計并制作流量自調(diào)控器件，該器件集成九個微閥，可精確匹配細(xì)胞分選器件所需的鞘液和樣品液。最后，將細(xì)胞分選器件、流量自調(diào)控器件進行集成，制成具有流量自調(diào)控功能的細(xì)胞

7、高通量分選器件。該集成器件體積小巧(51×53×2.7mm3)，成本低廉（～3.5元），滿足低成本、可拋棄式芯片應(yīng)用需求。
　　(4)開展循環(huán)腫瘤細(xì)胞自動分選儀器研制與應(yīng)用研究:基于氣壓驅(qū)動流系統(tǒng)的設(shè)計理念，研制儀器樣機。首先，分析儀器的應(yīng)用需求，明確微流控器件與儀器控制系統(tǒng)的技術(shù)參數(shù)。針對上述參數(shù)，對關(guān)鍵電氣元件進行選型，詳細(xì)設(shè)計儀器的機械結(jié)構(gòu)。其次，開發(fā)儀器的細(xì)胞分選模式、產(chǎn)品液回流模式、細(xì)胞富集模式和全自動模式。對各模式下的

8、電氣元件動作進行分解，并編寫系統(tǒng)軟件程序。接著，對組裝后的儀器進行調(diào)試，預(yù)設(shè)最佳工作參數(shù)。然后，檢驗儀器的工作性能，測試儀器工作時的壓力流量數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)儀器在細(xì)胞分選時段的鞘液流量為10.91±0.34ml/min，樣品液流量為1.26±0.03ml/min，滿足細(xì)胞精確分選所需的流量條件。最后，選擇儀器的全自動模式對人體血液中的乳腺癌細(xì)胞MCF-7進行高通量分選與富集，發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞移除率達到99％以上，癌細(xì)胞捕獲率約80％，癌細(xì)胞純度約3