鐵調(diào)素對成骨細(xì)胞成骨活性的影響及其機理的相關(guān)研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松主要原因是骨代謝異常，其防治是一個既傳統(tǒng)、又不斷發(fā)展的多學(xué)科、多因素相關(guān)的課題，傳統(tǒng)研究大多圍繞著“鈣離子代謝”展開，涉及的預(yù)防、治療手段主要是鈣的基礎(chǔ)干預(yù)、成骨細(xì)胞干預(yù)、破骨細(xì)胞干預(yù)等。而在骨代謝異常眾多影響因素中，近幾年關(guān)于鐵代謝與骨代謝的研究非常令人鼓舞和欣喜，針對體內(nèi)“鐵離子”代謝與骨質(zhì)疏松癥關(guān)系的研究報告越來越多，許多結(jié)果非常具有臨床意義；目前這一領(lǐng)域主要觀點是：(1)高齡女性大多伴有鐵過載發(fā)生；(2)離體、在體、臨床

2、研究資料顯示鐵過載與骨質(zhì)疏松指標(biāo)顯著相關(guān)；(3)運用降低鐵過載的方法能明顯改善骨質(zhì)疏松相關(guān)指標(biāo)；(4)在降低“鐵過載”方法中，2001年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性“鐵調(diào)素(hepcidin)”具有良好的臨床運用前景。
　　 本課題主要研究鐵調(diào)素干預(yù)成骨細(xì)胞(hFOB1.19)后，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡、鈣化活性情況、鈣離子與鈣離子通道變化情況，探究“鐵調(diào)素對成骨細(xì)胞影響”、“鐵調(diào)素對成骨細(xì)胞鈣離子影響初步機理”，為運用鐵調(diào)素干預(yù)骨質(zhì)疏松提供部分

3、實驗資料。本研究主要分為以下三個部分：
　　 第一部分：鐵調(diào)素、去鐵胺、枸櫞酸鐵銨對成骨細(xì)胞(hFOB1.19)增殖的比較研究
　　 目的：研究不同濃度鐵調(diào)素(Hepcidin)、去鐵胺(Desferrioxamine)、枸櫞酸鐵銨(FAC)對人成骨細(xì)胞增殖的影響，探討鐵在人體骨質(zhì)疏松形成中的作用。
　　 方法：取購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫的人成骨細(xì)胞株(hFOB1.19)在分別含有鐵調(diào)素(0，100，200，40

4、0，800，1200 nmol/L)，去鐵胺(0，2，10，100，200μmol/L)和枸櫞酸鐵銨(0，2，10，100，200μmol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、48小時后，采用MTT法檢測成骨細(xì)胞增殖活性的變化。
　　 結(jié)果：24、48小時后，濃度為(10-200μmol/L)的去鐵胺和枸櫞酸鐵銨可抑制成骨樣細(xì)胞增殖，與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)，且具有一定的劑量時間效應(yīng)。鐵調(diào)素(100-800 nmol/L)

5、對成骨樣細(xì)胞增殖無明顯影響作用(P>0.05)，并無時間效應(yīng)，在高劑量鐵調(diào)素(1200 nmol/L)對成骨細(xì)胞有抑制作用(P<0.05)。
　　 結(jié)論：成骨細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的鐵離子過高或過低都會顯著抑制成骨細(xì)胞增殖；鐵調(diào)素對成骨細(xì)胞增殖無影響劑量范圍明顯增大，這些區(qū)別可能與鐵調(diào)素主要通過結(jié)合細(xì)胞膜上的“膜轉(zhuǎn)鐵蛋白(Ferroportin)”來調(diào)控鐵離子的胞內(nèi)胞外平衡相關(guān)。
　　 第二部分：鐵調(diào)素(Hepcidin)對人成骨

6、細(xì)胞(hFOB1.19)增殖、凋亡、鈣化功能影響
　　 目的：探討鐵調(diào)素對人成骨細(xì)胞hFOB1.19的增殖、凋亡和礦化等成骨功能指標(biāo)的影響。
　　 方法：取購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫的人成骨細(xì)胞hFOB1.19細(xì)胞株進行體外實驗：分為空白對照組、100 nmol/L鐵調(diào)素組、200 nmol/L鐵調(diào)素組共3組。采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)觀察鐵調(diào)素作用48小時對成骨細(xì)胞的增殖、AnnexinV/PI染色和流式細(xì)胞儀檢

7、測鐵調(diào)素作用48小時對成骨細(xì)胞的凋亡變化影響、Vonkossa鈣化染色法檢測鐵調(diào)素作用15天對成骨細(xì)胞的礦化能力的影響。
　　 結(jié)果：MTT顯示鐵調(diào)素干預(yù)對成骨細(xì)胞的增殖與空白對照組相比無明顯變化(P>0.05)，在實驗劑量范圍內(nèi)，鐵調(diào)素對成骨細(xì)胞具有顯著的抗凋亡作用(P<0.01)，鈣結(jié)節(jié)的產(chǎn)生數(shù)量可隨鐵調(diào)素劑量增加而增加且具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：鐵調(diào)素對成骨細(xì)胞的增殖無明顯影響，但可顯著降

8、低成骨細(xì)胞hFOB1.19的凋亡率，增強成骨細(xì)胞的礦化功能。
　　 第三部分：L型鈣離子通道在鐵調(diào)素干預(yù)人成骨細(xì)胞(hFOB1.19)后胞內(nèi)鈣離子變化中的作用
　　 目的：研究電壓門控鈣離子通道的在鐵調(diào)素(Hepcidin)對成骨細(xì)胞(hFOB1.19)胞內(nèi)鈣離子變化的作用。
　　 方法：實驗分組三部分：1、雙蒸水和鐵調(diào)素(100nmol/l)分別干預(yù)成骨細(xì)胞(hFOB1.19)1小時；2、尼莫地平(2×10-5

9、mol/L)預(yù)處理成骨細(xì)胞(hFOB1.19)10分鐘，用相同體積的雙蒸水和鐵調(diào)素(100 nmol/l)分別干預(yù)成骨細(xì)胞(hFOB1.19)1小時；3、EDTA(2 mmol/l)預(yù)處理成骨細(xì)胞(hFOB1.19)10分鐘，用相同體積的雙蒸水和鐵調(diào)素(100 nmol/l)分別干預(yù)成骨細(xì)胞(hFOB1.19)1小時。收集以上各組細(xì)胞進行鈣離子熒光劑(fluo-3/AM)染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強度變化，以鈣離子熒光強度的高

10、低表示鈣離子濃度的高低。
　　 結(jié)果：1、鐵調(diào)素(100nmol/l)作用可以顯著升高成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強度(P<0.01)；2、用尼莫地平預(yù)處理后，與雙蒸水相比，鐵調(diào)素干預(yù)對細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強度無明顯升高(P>0，05)；3、用EDTA(2×10-5mol/L)預(yù)處理后，與雙蒸水相比，鐵調(diào)素干預(yù)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強度無明顯升高。
　　 結(jié)論：鐵調(diào)素可使胞外的鈣離子通過電壓門控鈣離子通道進入細(xì)胞內(nèi)，可能對細(xì)胞內(nèi)的鈣庫