脂多糖刺激單核巨噬細胞培養(yǎng)上清對成骨細胞成骨功能的影響.pdf

1、牙周炎是人類最常見的兩大口腔疾病之一,常造成牙齒的松動和移位,因此需要通過正畸和牙周聯(lián)合治療以最大限度恢復口頜系統(tǒng)的正常功能和美觀。目前臨床上普遍認為處于靜止期的牙周炎患者可以接受正畸治療。然而對于牙周炎個體是否適宜接受正畸治療以及該如何選擇大小合適的矯治力以及加力頻率等相關理論和臨床知識知之甚少,因此如何才能實現(xiàn)此類患牙安全有效的正畸治療已經(jīng)成為正畸醫(yī)生關注、并且急切需要解決的問題。
　　 然而在體外研究應力對于炎癥牙周組織改

2、建的影響首先需要在體外模擬牙周炎癥狀態(tài)。牙周病學的這方面研究為我們提供了思路。牙周炎是包括牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis,P.g)等革蘭陰性厭氧菌感染引起的慢性炎癥性疾病。這些致病菌外膜中主要結構成分之一的脂多糖(LPS),是最重要的牙周炎癥啟動因子之一,其可以刺激單核-巨噬細胞分泌白細胞介素(interlukin,IL)-1、6和8、TNF等多種炎性介質,從而在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。
　　 成骨細胞是骨形成

3、和骨吸收的細胞學基礎,其即是骨形成的效應細胞,同時又參與調控破骨細胞的分化與成熟,在骨代謝中起著重要調節(jié)作用。有研究表明牙槽骨丟失是骨吸收增加或骨形成降低或兩者共同作用的結果,因此作為牙周組織靶細胞的成骨細胞在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。
　　 因此本實驗嘗試和探索應用P.gingivalis LPS刺激單核巨噬細胞培養(yǎng)上清液建立類似于牙周炎癥時的環(huán)境,并以此上清液作用于成骨細胞,從細胞及分子水平上觀察不同濃度Pg-LP

4、S刺激單核巨噬細胞培養(yǎng)上清液對成骨細胞生物學行為的效應,為體外建立牙周炎模型及進一步從細胞和分子水平探討炎癥狀態(tài)下正畸力對牙周骨改建的影響奠定了基礎。本論文由三部分組成:
　　 第一部分:Pg-LPS刺激RAW264.7表達TNF-α、IL-1β和IL-6的定量研究
　　 目的:定量研究牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis Pg)脂多糖(LPS)刺激小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7表達IL-

5、1β、IL-6和TNF-α的水平。為后期在體外建立牙周炎癥模型以及探討應力對炎癥狀態(tài)下骨改建的影響奠定基礎。
　　 方法：采用ELISA試劑盒定量檢測不同濃度的Pg-LPS(1ng/ml,100ng/ml,10ug/ml)作用RAW264.7細胞6h,12h,24h和48h后分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。
　　 結果：Pg-LPS刺激小鼠單核巨噬細胞RAW264.7可以產(chǎn)生炎性物質IL-1β、IL-6和TN

6、F-α,且與Pg-LPS的濃度和刺激時間呈依賴性。以1ng/ml的LPS濃度刺激RAW264.7不同時間點后收集的上清中IL-1β、IL-6和TNF-α表達未見明顯變化,當LPS濃度為100ng/ml時,IL-1β的釋放量從25.71±10.89到70.36±2.32,IL-6的釋放量從59.59±1.26到419.31±12.36,TNF-α的釋放量從22.56±1.83到49.58±7.44。當LPS濃度為10μg/ml時,IL-1

7、β的釋放量從31.20±7.36到83.92±2.89,IL-6的釋放量從65.70±1.54到486.62±17.35,TNF-α的釋放量從30.12±1.45到113.93±8.39。
　　 結論：Pg-LPS刺激小鼠單核巨噬細胞RAW264.7可釋放炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α,并呈現(xiàn)時間依賴性和濃度依賴性,與體內牙周炎癥部位的環(huán)境具有一定的相似性。
　　 第二部分:Pg-LPS刺激RAW264.7的炎

8、癥上清對成骨細胞增殖及堿性磷酸酶活性的影響
　　 目的:觀察經(jīng)牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Pg-LPS)刺激的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)上清對小鼠成骨細胞MC3T3一E1增殖和堿性磷酸酶活性的影響。
　　 方法：收集Pg-LPS刺激的RAW264.7培養(yǎng)上清,以不同稀釋濃度(10％、20％、30％、40％和50％)的培養(yǎng)上清作用于成骨細胞MC3T3-E124h和48h后,分別通過噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖活性及堿

9、性磷酸酶(ALP)試劑盒檢測堿性磷酸酶活性,采用SPSS12.0進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：MC3T3-E1經(jīng)不同稀釋濃度的培養(yǎng)上清刺激后,MC3T3-E1增殖活性和ALP活性均受抑制,且與培養(yǎng)上清的濃度呈濃度依賴性。
　　 結論：Pg-LPS刺激的RAW264.7培養(yǎng)上清可抑制MC3T3-E1的增殖和堿性磷酸酶活性。
　　 第三部分:Pg-LPS刺激RAW264.7的炎癥上清對成骨細胞OPG/RANKL,表達

10、的影響
　　 目的:觀察經(jīng)牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Pg-LPS)刺激的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)上清對小鼠成骨細胞MC3T3-E1 OPG/RANKL表達的影響。
　　 方法：收集Pg-LPS刺激的RAW264.7培養(yǎng)上清,以不同稀釋濃度(10％、20％、30％、40％和50％)的培養(yǎng)上清作用于MC3T3-E124h,用RT-PCR方法檢測細胞OPGmRNA/RANKLmRNA表達的變化,用免疫印跡法(weste