供體細(xì)胞-受體細(xì)胞線粒體DNA相容性對(duì)牛異亞種體細(xì)胞核移植效率的影響.pdf

1、體細(xì)胞核移植或稱克隆(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥的各個(gè)領(lǐng)域。在通常情況下,體細(xì)胞核移植或稱克隆是采用來(lái)源于同一物種或亞種的供體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞進(jìn)行的。以不同物種或同一物種內(nèi)不同亞種間來(lái)源的供體細(xì)胞和卵母細(xì)胞所進(jìn)行的異種或異亞種克隆效率依然偏低。眾所周知,成功的體細(xì)胞核移植有賴于受體卵母細(xì)胞支持供體細(xì)胞的基因組重編程從而去分化恢復(fù)到支持胚胎發(fā)育的全能性狀態(tài),這就要求供

2、體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞之間具有正常的相互作用。目前,人們已經(jīng)從表觀遺傳學(xué)如,DNA甲基化修飾、組蛋白修飾,以及卵母細(xì)胞重編程供體細(xì)胞效能等方面對(duì)影響種內(nèi),種間,以及亞種內(nèi)和亞種間克隆效率的因素進(jìn)行了一系列深入的研究。但是,對(duì)于影響異種間和異亞種間體細(xì)胞核移植效率的分子機(jī)理,諸如核-質(zhì)互作、供體細(xì)胞-受體卵母細(xì)胞線粒體相容性等方面,人們還缺乏了解。
　　 作為高等動(dòng)物中唯一核外遺傳物質(zhì)的線粒體,是胞漿中最豐富的細(xì)胞器。它是細(xì)胞進(jìn)行能

3、量代謝,有氧呼吸、電子傳遞-氧化磷酸化,維持細(xì)胞正常生理機(jī)能的“動(dòng)力工廠”。在參與線粒體生物合成及正常生理功能行使的蛋白質(zhì)中約有1,500種是由核基因組負(fù)責(zé)編碼的。也就是說(shuō),其正常功能的行使受到了核基因組和線粒體基因組(mtDNA)的雙重控制。因此,要維持線粒體的正常功能就要求細(xì)胞核與胞漿中的線粒體之間必須有廣泛的相容性。這就為人們研究核-質(zhì)互作提供了良好的模型。
　　 在本課題的研究中,我們首先通過(guò)雙重PCR-RFLP技術(shù)對(duì)2

4、104頭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(1635頭荷斯坦奶牛和469頭魯西黃牛)進(jìn)行了線粒體DNA單倍型的分型鑒定。并摸索了應(yīng)用高分辨熔解曲線突變檢測(cè)(High-resolution melting,HRM)方法,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行高通量、高穩(wěn)定性,快速大規(guī)模檢測(cè)線粒體基因突變的新技術(shù)。在鑒定得到的線粒體四種單倍型中,以A-型和B-型兩種單倍型為主。我們以來(lái)源于兩個(gè)不同亞種牛的卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì),以荷斯坦奶牛來(lái)源的牛耳成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞,進(jìn)行荷斯坦奶牛體細(xì)

5、胞核移植實(shí)驗(yàn),探討了用魯西黃牛代替荷斯坦奶牛作卵母細(xì)胞供體,來(lái)克隆荷斯坦奶牛的可行性。同時(shí),以兩個(gè)不同亞種牛作代孕牛,與不同亞種牛卵母細(xì)胞生成的克隆胚互相組合,進(jìn)行胚胎移植,進(jìn)一步分析不同亞種牛卵母細(xì)胞構(gòu)成的克隆胚移植于不同亞種的代孕牛后,影響妊娠效率的可能因素,為開(kāi)展牛的異亞種間核移植提供了科學(xué)資料。最后,我們將荷斯坦奶牛來(lái)源的A-線粒體DNA單倍型的供體細(xì)胞分別移植到不同單倍型(A-型和B-型)的荷斯坦奶牛或魯西黃牛的卵母細(xì)胞中,分

6、析比較了二者在融合率、分裂率、囊胚率等體外發(fā)育效率方面的異同；以及在將不同牛亞種卵母細(xì)胞來(lái)源克隆囊胚移植給代孕牛后,二者在妊娠率、產(chǎn)犢率以及活產(chǎn)率等方面體內(nèi)發(fā)育效率方面的差異。通過(guò)比較不同牛亞種來(lái)源重構(gòu)胚中ATP含量、全基因組H3-K9甲基化狀態(tài)以及胚胎發(fā)育多能性相關(guān)基因Oct4,Sox2和Nanog啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平,驗(yàn)證了供體細(xì)胞-受體卵母細(xì)胞間mtDNA單倍型相容性對(duì)牛異亞種間體細(xì)胞核移植的效率具有重要影響。我們的實(shí)驗(yàn)表明,