豬體細(xì)胞核移植相關(guān)技術(shù)研究.pdf

1、1．探討了豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中減數(shù)分裂進(jìn)程和卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力。(1)不同直徑卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞的成熟進(jìn)程及各時(shí)相出現(xiàn)的時(shí)間存在差異。直徑>2mm的卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)16 h，大部分發(fā)生GVBD(germinal vesicle breakdown)；卵母細(xì)胞GV期的比率由0h的68.00％下降到16h的15.38％；成熟培養(yǎng)20h時(shí)，終變期(diakinesis，DK)的比率達(dá)到峰值(27.06％)，而M I的峰值(69.69

2、％)出現(xiàn)在培養(yǎng)后28h；成熟培養(yǎng)32～44h時(shí)，Ana-I /Tel-I期的比率達(dá)到最高(53.33％)：成熟培養(yǎng)48h時(shí)，MⅡ期的比率達(dá)到最大值(63.64％)。(2)不同直徑卵泡的卵母細(xì)胞體外成熟后的孤雌發(fā)育能力不同。直徑<2mm、直徑2～6mm、直徑>6mm的卵泡的卵母細(xì)胞的成熟率分別為5.12％，66.63％和46.72％；分裂率分別為1.42％，72.19％和58.54‰囊胚率分別為0、28.76％和23.13％。直徑<2mm

3、和>6mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞的卵裂率明顯低于直徑2～6mm卵泡的卵母細(xì)胞的卵裂率(P<0.05)。直徑2～6mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞體外成熟較快，體外發(fā)育潛能較高。 2．探討了激素和生長(zhǎng)因子對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成熟液中添加0.1μg/mL FSH的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于添加0.01IU/mL人絕經(jīng)期促性腺激素(hMG)的卵母細(xì)胞成熟率(P<0.05)，但兩組間的分裂率和囊胚率差異不顯著(P>0.05)。豬卵母細(xì)胞分

4、別在添加有0、10、30、50、70或90ng/mL表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的成熟液中成熟培養(yǎng)后進(jìn)行孤雌激活，50ng/mL EGF組的成熟率達(dá)到66.89％，孤雌激活的分裂率達(dá)到84.90％，囊胚率達(dá)到30.20％，成熟率顯著高于其余各組，分裂率和囊胚率高于對(duì)照組。在成熟液中添加10ng/mL胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)顯著提高豬卵母細(xì)胞的第一極體排出率。在成熟液中同時(shí)添加50ng/mL EGF和10ng/mL IGF-I顯著提高豬卵

5、母細(xì)胞的孤雌發(fā)育能力(P<0.05)。分別使用以TCM-199、NCSU-23(North Carolina State University-23，北卡大學(xué)胚胎培養(yǎng)液)和PZM-3為基礎(chǔ)液的成熟液進(jìn)行成熟培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞，各組間在分裂率，成熟率和囊胚率方面差異不顯著(P>0.05)，表明均可用于豬卵母細(xì)胞的體外成熟和體外培養(yǎng)。 3．系統(tǒng)探討了孤雌激活方法對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)濃度為9％的乙醇(EH)激活

6、處理10min效果好于15min；(2)用9％EH激活處理10min后，再用2μmol/L 6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)培養(yǎng)處理3～4h的卵母細(xì)胞分裂率及囊胚率分別為82.86％和22.86％，顯著高于再用10μg/mL放線菌酮(CHX)+10mmol/L SrCL2(Sr2+)、10 mmol/L Sr2+2μmol/L 6-DMAP、10μg/mL CHX+2μmol/L6-DMAP或10 pg/mL CHX+2μmol/L6-

7、DMAP+10 mmol/LSr2+培養(yǎng)處理3～4h的卵母細(xì)胞。(3)比較幾種激活方法(5μmol/L Ion激活處理5min，9％乙醇激活處理10min，50 v/mm和50μs的電脈沖2次)的豬卵母細(xì)胞孤雌激活效果發(fā)現(xiàn)，離子霉素(Ion)的豬卵母細(xì)胞孤雌激活效果最好，囊胚率達(dá)到37.50％。(4)卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)其成熟后的孤雌發(fā)育有顯著影響，4～6層和6層以上卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟后的孤雌激活分裂率(68.99％和75

8、.36％)和囊胚率(32.56％和37.68％)顯著高于其它組(p<0.05)。 4．對(duì)豬卵丘細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離和傳代培養(yǎng)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬卵丘細(xì)胞單層的生長(zhǎng)需要5～6d；運(yùn)用組織塊法和酶消化法獲得胎兒成纖維細(xì)胞單層的生長(zhǎng)時(shí)間分別為10～11d和8～9d。酶消化法和鋼網(wǎng)過(guò)濾篩選法可獲得豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞，豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞單層生長(zhǎng)需要3～5d。豬胎兒成纖維細(xì)胞冷凍解凍后，復(fù)蘇率為68.36％。通過(guò)培養(yǎng)和觀

9、察，豬胎兒成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)形成有規(guī)則的生長(zhǎng)曲線。 5．對(duì)豬體細(xì)胞核移植的方法及影響因素進(jìn)行了探索。(1)豬卵母細(xì)胞體外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h后，分別進(jìn)行去核構(gòu)建重構(gòu)胚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成熟44h和48h的卵母細(xì)胞核移植后的融合率(58.99％和56.51％)、卵裂率(67.52％和65.73％)和囊胚率(22.78％和15.96％)較高，其中卵齡為44h的分裂率與囊胚率顯著高于卵齡為40h、

10、36h、32h、28h的卵母細(xì)胞(P<0.05)。卵齡為48h的融合率高于卵齡為52h的卵母細(xì)胞(P<0.05)。(2)盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view系統(tǒng)去核法的去核率分別為76.33％，100.00％，98.40％，前者低于后兩者(P<0.05)；三種去核方法去核的卵母細(xì)胞核移植后，分裂率以Hoechest染色法較低(P<0.05)，但融合率和囊胚率差異不顯著(P>0.05)。(3)不同注核方法(細(xì)

11、胞質(zhì)內(nèi)注射法和透明帶下注射法)的核移植效果研究結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射法的分裂率為(68.13％和60.37％)與囊胚率(6.44％和8.08％)差異均不顯著(P>0.05)。 6．探討了供體細(xì)胞種類及其培養(yǎng)處理方法對(duì)豬體細(xì)胞核移植效果的影響。(1)比較胎兒成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞的核移植效果發(fā)現(xiàn)，胎兒成纖維細(xì)胞的融合率(64.74％)高于顆粒細(xì)胞(51.05％)和卵丘細(xì)胞(56.89％)，但三種細(xì)胞的卵裂率及

12、囊胚率差異不顯著(P>0.05)。(2)不同代數(shù)的胎兒成纖維細(xì)胞的核移植效果的研究發(fā)現(xiàn)，6～9代的融合率顯著高于3～5代和>10代的成纖維細(xì)胞(P<0.05)，但卵裂率和囊胚率差異不顯著(P>0.05)。(3)不同性別豬胎兒成纖維細(xì)胞核移植效果的研究發(fā)現(xiàn)：雄性胎兒成纖維細(xì)胞核移植的融合率和分裂率與雌性胎兒成纖維細(xì)胞相比差異不顯著(P>0.05)，但囊胚率顯著低于雌性胎兒成纖維細(xì)胞(P<0.05)。(4)100％長(zhǎng)滿匯合的胎兒成纖維細(xì)胞的

13、核移植融合率高于70～80％匯合的胎兒成纖維細(xì)胞(P<0.05)，分裂率高于血清饑餓培養(yǎng)的胎兒成纖維細(xì)胞(P<0.05)，但囊胚率差異不顯著。(5)豬胎兒成纖維細(xì)胞冷凍解凍后的核移植分裂率和囊胚率均顯著低于新鮮和4℃冷藏的細(xì)胞(P<0.05)，雖然融合率無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明豬胎兒成纖維細(xì)胞解凍后不宜直接進(jìn)行核移植。(6)表面光滑的豬卵丘細(xì)胞做供體細(xì)胞的核移植后的分裂率和囊胚率均顯著高于表面粗糙的豬卵丘細(xì)胞做供體細(xì)胞的核移植后