ROCK蛋白在豬體受精早期胚胎發(fā)育中的作用.pdf

1、豬作為我國(guó)重要家畜之一，從基因組大小和代謝來(lái)看，是最接近人類的哺乳動(dòng)物。以豬體外早期胚胎為研究對(duì)象，研究其在胚胎植入前的發(fā)育規(guī)律，可提高胚胎體外培養(yǎng)存活能力與克隆動(dòng)物生產(chǎn)效率。多種作用因子共同調(diào)節(jié)豬早期胚胎發(fā)育過(guò)程，從而保證胚胎的正常發(fā)育，而相關(guān)因子的調(diào)控起著關(guān)鍵性的作用。有研究表明，Rho相關(guān)的卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinases，ROCKs)在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、

2、細(xì)胞分泌和細(xì)胞凋亡方面均發(fā)揮著重要的作用。近來(lái)有大量研究表明參與ROCK參與調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟和胚胎的發(fā)育的過(guò)程。
　　本研究主要探討ROCK1與ROCK2在豬體外胚胎發(fā)育中的作用及其對(duì)囊胚質(zhì)量的影響。首先，我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和免疫熒光染色檢測(cè)了ROCK1和ROCK2在各期卵母細(xì)胞和胚胎中的表達(dá)與分布。結(jié)果顯示，ROCK mRNA在豬卵母細(xì)胞成熟GV期至MⅡ期，以及豬早期胚胎發(fā)育的合子至桑葚胚期均有表達(dá);從早期胚胎2細(xì)胞期到8

3、細(xì)胞期ROCK1和ROCK2mRNA顯著增加，當(dāng)囊胚形成時(shí)表達(dá)量開(kāi)始降低，到囊胚時(shí)期幾乎不表達(dá)。ROCK1的蛋白檢測(cè)顯示從豬卵母細(xì)胞GV期到胚胎4細(xì)胞期在細(xì)胞核中表達(dá)較強(qiáng)，從8細(xì)胞期開(kāi)始均勻分布于細(xì)胞中，囊胚期表達(dá)量最低;ROCK2在GV期主要分布于細(xì)胞膜下，從MⅠ期開(kāi)始均勻分布于細(xì)胞中，8細(xì)胞期表達(dá)量降低。為了檢測(cè)ROCK在胚胎發(fā)育中的作用，我們?cè)谂咛ヅ囵B(yǎng)過(guò)程中添加ROCK抑制劑Y27632及其激活劑LPA來(lái)干擾ROCK信號(hào)，以此研究

4、ROCK對(duì)胚胎發(fā)育的影響。研究結(jié)果顯示，隨著Y27632濃度的提高，卵裂率和囊胚率下降，部分囊胚形態(tài)異常;當(dāng)Y27632濃度達(dá)到15μM時(shí)，不能形成正常的囊胚。與單獨(dú)添加10μM Y27632相比，同時(shí)添加10μM LPA可使囊胚率提高，而單獨(dú)添加LPA的胚胎發(fā)育情況優(yōu)于都不添加的對(duì)照組。ROCK的抑制或激活還對(duì)囊胚的細(xì)胞數(shù)目有影響，與對(duì)照組相比，Y27632處理組的囊胚細(xì)胞總數(shù)下降，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass，ICM)和

5、滋養(yǎng)層(Trophoblast，TE)的比例(ICM/TE)變大，TE細(xì)胞數(shù)減少，而ICM細(xì)胞數(shù)異常增多。為了找出ROCK在豬早期胚胎發(fā)育中的具體作用時(shí)期，我們?cè)谂咛グl(fā)育到2d后的不同階段添加Y27632，結(jié)果顯示，在胚胎發(fā)育的2-7d內(nèi)，ROCK對(duì)囊胚的形成有作用，尤其是在2-3d胚胎卵裂與4-5d胚胎進(jìn)行致密化的過(guò)程中，此時(shí)如果抑制ROCK會(huì)使囊胚難以形成。Y27632會(huì)對(duì)豬早期胚胎發(fā)育造成一定的阻礙，導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，囊胚率顯著降