四種發(fā)育調(diào)控因子mRNA在早期雞胚中的分布及其在胚胎發(fā)育中的作用研究.pdf

1、采用體外轉(zhuǎn)錄的方法，分別在SP6和T7 RNA聚合酶的作用下合成地高辛(DIG)標(biāo)記的Cdc25A，Cdc25B，Sox2和Mnb/Dyrk RNA探針。通過(guò)全胚胎原位雜交的方法檢測(cè)早期雞胚中上述四種基因mRNA的表達(dá)模式。結(jié)果表明，四種基因mRNA的表達(dá)模式是部分重疊或互補(bǔ)的，大部分表達(dá)于整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，但也有表達(dá)于體節(jié)和肢芽。在特異的區(qū)域，四種基因的mRNA豐度是存在差異的。在雞胚早期不同發(fā)育階段，四種基因的表達(dá)模式支持

2、了它們可能在早期的雞胚發(fā)育中具有重要的調(diào)節(jié)功能，而且它們之間具有一定的相互調(diào)控作用。
　　 試驗(yàn)Ⅰ Cdc25A RNA探針的制備本試驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR方法從雞胚中擴(kuò)增Cdc25A的基因片段，通過(guò)T-A克隆將其連接于pGM-T質(zhì)粒載體中構(gòu)成Cdc25A/pGM-T重組質(zhì)粒。并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α株感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增，經(jīng)挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)、小量提取質(zhì)粒，再根據(jù)pGM-T的多克隆酶切位點(diǎn)，進(jìn)行酶切鑒定，然后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證

3、。測(cè)序正確后，將陽(yáng)性株擴(kuò)增后提取的質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和SpeⅠ進(jìn)行酶切，使其完全線性化?；厥彰盖衅?，作為合成正、反義RNA探針的模板。分別利用pGM-T中T7和SP6的RNA聚合酶的啟動(dòng)子，在RNA聚合酶的作用下，以線性化的Cdc25A/pGM-T為模板，按Roche地高辛標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書，利用試劑盒中含有的DIG-dUTP底物混合物，分別用Sp6和T7轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，成功轉(zhuǎn)錄得到長(zhǎng)度為183nt的正、反義DIG標(biāo)記的

4、RNA探針，為后續(xù)的原位雜交試驗(yàn)做好了探針的準(zhǔn)備。
　　 試驗(yàn)Ⅱ Cdc25A mRNA在早期雞胚中的分布本試驗(yàn)通過(guò)全胚胎原位雜交的方法，使用Cdc25A RNA探針檢測(cè)其mRNA在早期雞胚中的分布。結(jié)果表明，在9HH(Hamburger and Hamilton)階段，腦部的雜交信號(hào)相對(duì)于后期階段(10，11HH)不強(qiáng)，但中部神經(jīng)管雜交信號(hào)相對(duì)于后期階段較強(qiáng)。后部神經(jīng)溝，尾部神經(jīng)板雜交信號(hào)此時(shí)較強(qiáng)。體節(jié)部位信號(hào)最弱。在10HH

5、階段，腦部雜交信號(hào)此時(shí)很強(qiáng)，但中部神經(jīng)管雜交信號(hào)很弱。體節(jié)處的雜交信號(hào)也較少。后部神經(jīng)溝，尾部神經(jīng)板雜交信號(hào)依然較強(qiáng)。在11HH階段，頭部區(qū)域的雜交信號(hào)仍然最強(qiáng)，中部神經(jīng)管雜交信號(hào)有所加強(qiáng)，后部神經(jīng)溝，尾部神經(jīng)板雜交信號(hào)有所減弱.此時(shí)，在心原基中未見(jiàn)雜交信號(hào)。這些結(jié)果說(shuō)明，Cdc25A mRNA的表達(dá)模式與增殖中的神經(jīng)上皮分布區(qū)域基本一致。
　　 試驗(yàn)Ⅲ Cdc25B RNA探針的制備及其mRNA在早期雞胚神經(jīng)管、體節(jié)和肢芽中的

6、分布本試驗(yàn)使用分子克隆的方法獲得特異性Cdc25B基因目的片段，以線性化的Cdc25B/pGM-T重組質(zhì)粒為模板，應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄的方法合成長(zhǎng)度為575nt的正、反義地高辛標(biāo)記的Cdc25B RNA探針。通過(guò)全胚胎原位雜交方法，用體外轉(zhuǎn)錄的Cdc25BRNA探針探查Cdc25B mRNA在早期雞胚中的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式。結(jié)果表明，在5HH階段，Cdc25B原位雜交信號(hào)在整個(gè)胚胎中分布是微弱的，特別是在頭部區(qū)域，但在亨氏節(jié)(Hensen's nod

7、e)中雜交信號(hào)可見(jiàn)。此時(shí)，Cdc25B雜交信號(hào)不對(duì)稱地分布在亨氏節(jié)的左側(cè)。在6HH階段，腦部雜交信號(hào)已經(jīng)清晰可見(jiàn)。雜交信號(hào)在亨氏節(jié)和原條兩側(cè)是不對(duì)稱的。到了8-HH期，腦部雜交信號(hào)很強(qiáng)，并且在神經(jīng)褶中Cdc25B原位雜交信號(hào)也較強(qiáng)。此時(shí)，神經(jīng)褶兩側(cè)雜交信號(hào)分布是對(duì)稱的，但亨氏節(jié)兩側(cè)信號(hào)仍然是不對(duì)稱的。在全胚胎原位雜交的橫斷切片中，Cdc25B原位雜交信號(hào)分布在底板。在即將封閉的神經(jīng)管中，雜交信號(hào)呈現(xiàn)出腹背遞減的濃度梯度，而且，在大部分尾

8、部神經(jīng)上皮中缺乏雜交信號(hào)。體節(jié)中的雜交信號(hào)很弱。直到8HH階段，Cdc25B原位雜交信號(hào)在腦部很強(qiáng)。在體節(jié)中的雜交信號(hào)也較強(qiáng)。從Cdc25B原位雜交的橫斷切片來(lái)看，在8HH階段，雜交信號(hào)在神經(jīng)管和神經(jīng)溝兩側(cè)是對(duì)稱的，但在即將封閉的神經(jīng)管和神經(jīng)溝中，雜交信號(hào)仍然呈現(xiàn)出腹背遞減的濃度梯度。從9－到10HH階段，雜交信號(hào)分布于CNS，包括腦部，神經(jīng)管和神經(jīng)溝。特別是，腦部的雜交信號(hào)很強(qiáng)，但是在10HH階段，在尾部神經(jīng)板中沒(méi)有雜交信號(hào)。此外，體

9、節(jié)中的信號(hào)較強(qiáng)。在12HH階段，Cdc25B原位雜交信號(hào)分布于CNS，特別是腦部比先前發(fā)育階段信號(hào)更強(qiáng)。此時(shí)，體節(jié)中的雜交信號(hào)較強(qiáng)。在三天的雞胚(18HH階段)切片中，Cdc25B原位雜交信號(hào)仍然分布在神經(jīng)管的腹部區(qū)域。體節(jié)中信號(hào)很強(qiáng)。同時(shí)在肢芽的頂端，即AER區(qū)域，Cdc25B原位雜交信號(hào)很強(qiáng)。在后期的23HH階段，雜交信號(hào)廣泛分布于發(fā)育中的脊髓，主要分布在腹部區(qū)域，并且在腹部區(qū)域的外側(cè)緣檢測(cè)到強(qiáng)烈的信號(hào)。此時(shí)，體節(jié)中信號(hào)也較強(qiáng)。然而

10、，自始至終，在早期雞胚不同發(fā)育階段，脊索都是陰性的。所有這些結(jié)果說(shuō)明，在早期雞胚不同發(fā)育階段，Cdc25B mRNA主要分布于CNS，在體節(jié)和肢芽中也有不同程度地分布。但是，大部分尾部神經(jīng)上皮中缺乏Cdc25B mRNA分布。
　　 試驗(yàn)Ⅳ Sox2 RNA探針的制備及其mRNA在早期雞胚中的原位雜交檢測(cè)本試驗(yàn)應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄的方法合成正、反義地高辛標(biāo)記的Sox2 RNA探針。通過(guò)全胚胎原位雜交方法，使用體外轉(zhuǎn)錄的探針檢測(cè)Sox2

11、mRNA在10HH階段雞胚中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，Sox2原位雜交信號(hào)沿著CNS區(qū)域分布。雜交信號(hào)在腦部很強(qiáng)。中部神經(jīng)管的雜交信號(hào)較弱。然而，在尾部神經(jīng)板雜交信號(hào)較強(qiáng)。此外，在體節(jié)中并未見(jiàn)到雜交信號(hào)。這些結(jié)果說(shuō)明，Sox2 mRNA主要分布在CNS未成熟的神經(jīng)上皮中。Sox2 mRNA與Cdc25A mRNA在早期雞胚中的分布模式具有相似性。
　　 試驗(yàn)Ⅴ Mnb/Dyrk RNA探針的制備及其全雞胚原位雜交反應(yīng)本試驗(yàn)應(yīng)用體外轉(zhuǎn)

12、錄的方法合成正、反義地高辛標(biāo)記Mnb/Dyrk的RNA探針。通過(guò)全胚胎原位雜交方法，用體外轉(zhuǎn)錄的RNA探針檢測(cè)了10HH階段的雞胚M(jìn)nb/Dyrk mRNA的表達(dá)模式。結(jié)果表明，Mnb/Dyrk原位雜交信號(hào)在CNS中很強(qiáng)。在封閉的神經(jīng)管中可檢測(cè)到雜交信號(hào)，包括將來(lái)發(fā)育為前腦，中腦和菱腦的區(qū)域，以及脊髓。在頭部有很強(qiáng)的雜交信號(hào)。尾部神經(jīng)板區(qū)域雜交信號(hào)很弱。此外，在體節(jié)中雜交信號(hào)很弱。這些結(jié)果說(shuō)明，Mnb/Dyrk mRNA主要分布于CNS