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文檔簡介
1、本論文是基于金屬編碼探針、生物夾心免疫及電化學(xué)溶出技術(shù)構(gòu)建了一系列簡單、快速、靈敏、低成本的多元電化學(xué)免疫分析方法,用于同時檢測多種腫瘤標(biāo)志物(甲胎蛋白 AFP、癌胚抗原CEA、糖類抗原CA19-9)。多元電化學(xué)免疫分析方法是在單元檢測基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分析方法,本文依據(jù)不同金屬的溶出峰電位不同,來區(qū)別定義腫瘤標(biāo)志物,對應(yīng)的溶出峰電流來定量腫瘤標(biāo)志物,達(dá)到單次運(yùn)行同時測定多種腫瘤標(biāo)志物的目的。構(gòu)建的免疫分析方法使用免疫磁珠Dyna
2、beads、磁性分子印跡MMIPs作為捕獲探針,不僅簡化了分離步驟,還增加了待測物的富集量;使用高聚物Envision、石墨烯(G)、聚賴氨酸(PLL)作為載體,進(jìn)一步負(fù)載金屬編碼標(biāo)簽(量子點(diǎn)QDs、納米金Au、重組脫鐵鐵蛋白r-Apo及脫鐵鐵蛋白Apo)分別制備可分辨的信號標(biāo)簽。當(dāng)抗原抗體之間發(fā)生特異性免疫反應(yīng)后,隨即形成夾心免疫復(fù)合物。磁性分離后,執(zhí)行高靈敏度的溶出伏安技術(shù),在同一體系同時定量分析金屬元素,以定量多種腫瘤標(biāo)志物的含量
3、。
本論文的研究工作從以下三個方面展開:
1.基于聚合物-金屬信號放大標(biāo)簽和雙向溶出伏安法的多元電化學(xué)免疫分析方法
本章構(gòu)建了一個雙向溶出伏安免疫分析方法,同時檢測多種腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原CA19-9。我們采用Envision負(fù)載金屬納米粒子作為信號探針,免疫磁珠作為捕獲探針。Envision,一種長鏈聚合物,含有大量的辣根過氧化物酶和二抗。我們將其作為載體,標(biāo)記相應(yīng)的
4、一抗,并負(fù)載納米CdS、PbS、Au制備可分辨的信號探針。我們在磁珠Dynabeads上同時固定三種一抗,制備捕獲探針。通過夾心型免疫反應(yīng),形成免疫復(fù)合物。進(jìn)一步使用雙向溶出伏安法,定量分析金屬成分Cd、Pb、Au以檢測三種腫瘤標(biāo)志物。AFP、CEA、CA19-9檢測范圍分別為1 pg mL1-50 ng mL1,1 pg mL1-50 ng mL1,5 pg mL1-100 ng mL?1;檢測限分別為0.02 pg mL1,0.05
5、 pg mL?1,0.3 pg mL?1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明構(gòu)建的雙向多元免疫分析可同時檢測多種標(biāo)志物,具有靈敏度高、穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn),并在臨床免疫學(xué)方面擁有一定的應(yīng)用前景。
2.基于重組脫鐵鐵蛋白編碼的金屬標(biāo)簽構(gòu)建多元電化學(xué)免疫方法
本章構(gòu)建了一種多元電化學(xué)免疫分析方法,同時測定兩種腫瘤標(biāo)志物,采用AFP和CEA作為研究模型。我們使用重組脫鐵鐵蛋白編碼的金屬納米粒子(rApo-M)作為信號標(biāo)簽,雙模板磁性分子印跡(MMI
6、Ps)作為捕獲探針。我們在石墨烯(G)上原位合成納米金(Au)制備G-Au納米復(fù)合物,以負(fù)載重組脫鐵鐵蛋白(rApo-M)及標(biāo)記一抗(anti-AFP和anti-CEA)制備信號探針。弱堿性溶液中加入模板蛋白AFP和CEA,多巴胺(DA)在納米Fe3O4表面形成MMIPs以制備捕獲探針。夾心型免疫反應(yīng)后,信號探針固定到MMIPs表面。隨后使用電化學(xué)溶出技術(shù),分析檢測金屬成分Cd和Pb,量化腫瘤標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,同時測定AFP和CEA
7、線性范圍為0.001-5ng mL-1。AFP和CEA的檢出限分別為0.3和0.35pg mL-1(S/N=3)。此外,結(jié)果表明我們構(gòu)建的多元電化學(xué)免疫分析可拓展為其他生物標(biāo)志物的臨床篩查。
3.基于生物基聚合物納米探針構(gòu)建多元電化學(xué)免疫方法
本章構(gòu)建了一種新穎的夾心型電化學(xué)多元免疫方式,同時檢測雙分析物AFP和CEA。將甲胎蛋白和癌胚抗原的一抗包被磁珠作為捕獲探針。金屬編碼的脫鐵鐵蛋白(Cd-Apo和Pb-Apo)
8、及二抗分別通過納米金(AuNPs)交聯(lián)在聚賴氨酸(PLL)上,通過自組裝制備成信號探針。經(jīng)過夾心免疫反應(yīng),在磁珠上形成夾心免疫復(fù)合物。我們通過鉛(Cd)和鎘(Pb)的溶出電位不同來區(qū)別待測物。兩者的溶出峰電流分別與AFP和CEA的濃度相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明構(gòu)建的免疫策略實(shí)現(xiàn)了對AFP和CEA的同時檢測,線性范圍都為0.01-50 ng mL-1,檢測限為4 pg mL-1。該方法簡單、靈敏且環(huán)保。此外該方法成功應(yīng)用于同時檢測血清樣品中的AF
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