乙型肝炎患者HBV基因型-亞型的分析與臨床意義研究.pdf

1、背景：大量研究發(fā)現(xiàn)HBV基因型/亞型與病毒感染途徑、基因突變、疾病進(jìn)程和抗病毒療效具有一定相關(guān)性，且不同地域和人群的基因亞型分布有顯著差異。但在以往的研究中，HBV基因型和基因亞型分型的方法多采用PCR RFLP法，其檢測結(jié)果受到限制性內(nèi)切酶的功能狀態(tài)、酶的反應(yīng)條件及操作人員技術(shù)水平等影響較大，這些因素制約了PCRRFLP的檢驗(yàn)效能。傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物直接測序法獲得的信息直觀豐富，是基因亞型分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但其敏感性較低，通常只有104 I

2、U/ml水平，無論應(yīng)用于臨床檢測還是科學(xué)研究都很難達(dá)到理想的效果。此外，我們在分析大樣本量的序列數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)采用人工判斷和統(tǒng)計(jì)序列差異的方法工作量大、效率低，而國外已有的HBV序列分析數(shù)據(jù)庫都以歐美流行的A型、D型、E型HBV序列為主，且很多數(shù)據(jù)庫需要付費(fèi)才能使用。
　　 目的：本研究擬建立高度敏感特異的HBV序列擴(kuò)增方法，檢測HBV RT全基因和前C區(qū)所有突變；建立HBV序列數(shù)據(jù)庫，借助數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析和匯總功能，分析2377

3、例HBV序列的RT區(qū)耐藥突變情況、前C/BCP突變情況、CTL表位變異情況，并對基因亞型B2和C2在乙肝相關(guān)疾病進(jìn)展各個(gè)階段的比例進(jìn)行分析，從不同角度闡明HBV基因亞型與疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。
　　 內(nèi)容：選取2007年7月至2008年12月于解放軍302醫(yī)院就診的華北地區(qū)(北京、河北、山西、天津、內(nèi)蒙古五省)2377例慢性HBV感染患者(男性1981例，女性396例；年齡38±13歲)，其中慢性乙肝(CHB)患者1874例，乙肝相關(guān)

4、肝硬化(LC)354例，慢加急性肝衰竭(ACLF)32例，肝細(xì)胞癌(HCC)117例。診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照2000年9月(西安)全國會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)，排除乙丙重疊感染及HIV混合感染者。
　　 方法：提取慢性HBV感染患者血清HBV DNA，采用巢式PCR擴(kuò)增前S/S基因和前C/BCP區(qū)基因，對PCR產(chǎn)物直接測序。根據(jù)測得前S/S基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹確定基因型/亞型。建立包含耐藥突變分析、前C/BCP基因突變分析

5、、CTL變異分析等多種生物信息學(xué)功能的HBV序列數(shù)據(jù)庫，分析基因亞型B2和C2間，RT區(qū)耐藥突變r(jià)tL80I、rtV84M、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtT184A/I/L/P/S、rtS202G、rtM204I/V、rtN236T、rtM250L的發(fā)生率差異；分析前C/BCP區(qū)T1753A/C/G、T1758C、A1762T、G1764A、C1766T、T1768A、G1862T、G1896A、G1899A的突變

6、發(fā)生率差異；分析多聚酶區(qū)和表面抗原區(qū)CTL特異性表位變異頻率和變異類型差異；分析基因亞型B2和C2病毒在不同進(jìn)程病情患者中的分布頻率。
　　 結(jié)果：
　　 1.建立了高效敏感的HBV序列擴(kuò)增方法：通過對實(shí)驗(yàn)條件的不斷優(yōu)化，我們建立了高效、敏感的preS/S(包含RT全基因序列)區(qū)擴(kuò)增方法，可同時(shí)檢測HBV RT全基因和前c區(qū)所有突變；對RT耐藥突變的檢測敏感性達(dá)到了100 IU/ml，較國際公認(rèn)測序法的敏感性(≥104I

7、U/ml)提高了2個(gè)數(shù)量級；克服了高病毒載量耐受的難題，可同時(shí)檢測病毒載量相差1億倍的樣本。
　　 2.建立了大樣本患者的HBV序列數(shù)據(jù)庫：包含6800余例來自全國各地HBV感染患者的臨床相關(guān)資料，11000余條HBV功能序列信息，并具有相似性檢索、基因型分析、耐藥位點(diǎn)分析、前C/BCP區(qū)分析、CTL表位分析等多種生物信息學(xué)分析功能。
　　 3.闡明HBV基因型/亞型在華北地區(qū)的分布情況：對2377例患者進(jìn)行基因型/亞型

8、分型，檢出的HBV基因型有B、C、D三種，分別占83.8％(1992/2377)、15.5％(368/2377)和0.7％(17/2377)?；騺喰偷睦龜?shù)與在所有患者中的比率為B110例(0.4％)，B2344例(14.5％)，B36例(0.3％)，B48例(0.3％)，C128例(1.2％)，C2例1937(81.4％)，C3例21(0.9％)，C46例(0.3％)。B基因型中以B2占絕大多數(shù)(344/368，93.5％)；C型中以

9、C2占絕大多數(shù)(1937/1992，97.2％)；未發(fā)現(xiàn)其它基因型。華北地區(qū)各省市之間HBV基因型/亞型分布特點(diǎn)類似。
　　 4.闡明HBV基因型/亞型與疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系：
　　 a.不同基因亞型患者的性別比例、HBV DNA載量、ALT、AST、TBIL、CHE、PTA、PTT值之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 b.拉米夫定(LAM)相關(guān)耐藥突變位點(diǎn)rtL80I、rtV173L、rtL180M、rtM204I、rt

10、M204V的突變發(fā)生率均為C2高于B2，除M204V位點(diǎn)外，其余位點(diǎn)突變率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；阿德福韋耐藥和恩替卡韋耐藥突變發(fā)生率并無明顯差別(P>0.05)。
　　 c.基本核心啟動子(BCP)區(qū)突變位點(diǎn)T1753A/C/G、T1758C、A1762T/G1764A、C1766T、T1768A的突變發(fā)生率均為C2亞型高于B2亞型，除T1768A外差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；前C區(qū)突變位點(diǎn)G1896A則

11、為C2亞型低于B2亞型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 d.s區(qū)有5個(gè)CTL表位在基因亞型B2和C2之間的變異發(fā)生頻率不同：preS244-53、S14-22、S20-28、S88-96、S172-180，且其差異都有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；P區(qū)Pol455-463表位在基因亞型B2和C2間的變異發(fā)生頻率不同，其差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B2和C2亞型間各個(gè)CTL表位的變異類型也有很大區(qū)別，如B

12、2亞型病毒S38-47表位的變異類型主要為SLNFLGGTPV，而C2亞型則主要為SLNFLGGAPT；B2亞型S207-216表位的變異類型主要為NILSPFMPLL，C2亞型則為NILSPFLPLL。
　　 e.隨著患者病情以AHB→CHB→LC→ACLF→HCC的順序逐步發(fā)展，C2亞型在各組患者間的比例逐漸增大，在AHB患者中C2：B2患者例數(shù)比例為1.7，CHB患者中為5.7，LC患者中為7.5，ACLF患者中為8.0，

13、HCC患者中為15.3。
　　 結(jié)論：建立了以我國：HBV患者流行的B型和C型為主、包含完整患者資料、大量序列信息和多種生物學(xué)功能的序列數(shù)據(jù)庫。我國華北地區(qū)流行的HBV病毒以C型和B型為主，D型也有少量分布；其中C2和B2為主要亞型，占患者總數(shù)的95.9％。B2和C2兩種基因亞型病毒感染患者間的耐藥突變發(fā)生率有一定差異，LAM相關(guān)耐藥位點(diǎn)的突變發(fā)生率為C2亞型高于B2亞型，而ADV和ETV耐藥相關(guān)位點(diǎn)的突變發(fā)生率無明顯差異；BC