植物脫落酸受體PYL10在脫落酸結(jié)合前后的液體核磁共振動(dòng)態(tài)特性研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是生物體行使功能的最重要的生物大分子之一，研究蛋白質(zhì)在生理過程中的作用機(jī)制能夠幫助我們更好的了解生命的意義。大部分蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)依賴著其動(dòng)態(tài)變化，核磁共振由于能夠研究生物大分子在不同時(shí)間尺度上的運(yùn)動(dòng)特性而成為研究蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)和作用機(jī)制的重要工具。本文應(yīng)用生物化學(xué)方法分析了植物激素脫落酸(ABA)在擬南芥中的水溶性受體家族RCAR1/PYR/PYL中的成員PYL10對(duì)其下游信號(hào)因子2C類蛋白磷酸酶PP2C的作用機(jī)制。糾正了前人因偶

2、然因素得出“PYL10是一類不依賴于ABA的受體”的結(jié)論。本文還進(jìn)一步應(yīng)用液體核磁共振弛豫測(cè)量和約化譜密度函數(shù)分析方法揭示了PYL10在ABA結(jié)合前后的動(dòng)態(tài)特性，表明PYL10在結(jié)合ABA之后使得其結(jié)構(gòu)熵和蛋白質(zhì)柔性的增加。同時(shí)，本文還介紹了發(fā)展和應(yīng)用無標(biāo)記（Label-Free）質(zhì)譜定量檢測(cè)的方法研究大腸桿菌酪氨酸激酶C端酶活結(jié)構(gòu)域(ETK-CTD)在磷酸化過程中的關(guān)鍵位點(diǎn)Tyr574的磷酸化水平的動(dòng)態(tài)變化的工作，及簡(jiǎn)要介紹了植物內(nèi)向

3、整流鉀離子通道KAT1的初步電生理研究。
　　第一章先簡(jiǎn)要介紹了ABA受體的發(fā)現(xiàn)和分類。接著對(duì)水溶性的ABA受體RCAR1/PYR/PYL家族介導(dǎo)的ABA信號(hào)通路的主要內(nèi)容及其在植物體中的重要功能、RCAR1/PYR/PYL家族ABA受體結(jié)合ABA時(shí)的結(jié)構(gòu)變化和發(fā)揮作用的機(jī)制進(jìn)行了重點(diǎn)介紹。
　　第二章主要介紹了基于液體核磁共振自旋弛豫的蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析方法，并相關(guān)研究表明熱力學(xué)原理和動(dòng)力學(xué)的結(jié)合能夠更好地解釋蛋白質(zhì)-配體或

4、者蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制。
　　第三章介紹了采用鉬酸鹽與磷酸根的顯色反應(yīng)檢測(cè)PYL10在體外對(duì)PP2C(HAB1)磷酸酶活性的抑制，發(fā)現(xiàn)了與之前報(bào)道的結(jié)果（ABA非依賴性）相反的結(jié)果，即ABA依賴性，且這種依賴性會(huì)受到外源蛋白牛血清蛋白(BSA)的影響。生化分析結(jié)果表明PYL10和BSA不能形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
　　第四章針對(duì)BSA不是通過與PYL10直接相互作用影響其功能，可能是使PYL10蛋白的動(dòng)力學(xué)發(fā)生了變化而對(duì)功能

5、產(chǎn)生影響。我們對(duì)自由狀態(tài)的PYL10(apo-PYL10)和結(jié)合有ABA的PYL10(ABA/PYL10)進(jìn)行了液體核磁共振主鏈歸屬、弛豫數(shù)據(jù)的采集和約化譜密度函數(shù)分析以及ABA滴定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明PYL10對(duì)PP2C的磷酸酶活性抑制作用是通過ABA介導(dǎo)的主鏈柔性以及構(gòu)象熵的增加實(shí)現(xiàn)的。
　　第五章我們分別采用Label-Free質(zhì)譜相對(duì)定量和Western-blot定性分析了ETK-CTD在磷酸化過程中自磷酸化位點(diǎn)Tyr574磷酸